可溶性环氧化物水解酶抑制剂对内皮祖细胞归巢功能的影响＊

王振河，许丹焰，李卫华，谢 强，黄峥嵘，姜德谦△

1．厦门大学附属第一医院心内科，福建厦门361003；2．中南大学湘雅二医院心内科，长沙410011；

3．厦门市心血管病研究所，福建厦门361003）

环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）是具有强大生物活性的内生脂质环氧化合物，具有舒张血管、抗炎等作用［1－3］。EETs在细胞内由可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）迅速降解［4］，使其作用明显受限。因此，使用sEH抑制剂，抑制EETs在体内降解可有效增加EETs在细胞内浓度及效用。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在干细胞移植修复心肌梗死中扮演重要角色，研究表明EETs可通过多种机制激活EPCs［5－7］。EPCs从外周向心肌组织归巢为EPCs修复心肌梗死重要途径［8－10］，因此，增强EPCs归巢功能可能有效增强EPCs对梗死心肌的修复。本研究观察不同浓度sEH抑制剂对EPCs归巢功能的影响，以便为其在促进EPCs修复心肌梗死的研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料 本实验选用6周龄清洁级雄性云南昆明小鼠（中南大学湘雅二医院实验动物中心提供）作为EPCs的来源；CD34、CD133、CD31、Flk－1、Dil－acLDL、FITC－UEA－1购自美国Molecular probes公司；小动物呼吸机购自美国哈佛大学；胃蛋白酶、柠檬酸抗原修复缓冲液、DAB显色剂购自美国Vector公司。

1．2 方法

1．2．1 实验分组 依据可溶性环氧化物水解酶抑制剂（t－AUCB）不同浓度干预组分为6组，分别为0μmol／L t－AUCB、1μmol／L t－AUCB、10μmol／L t－AUCB、50μmol／L t－AUCB、100μmol／L t－AUCB干预组。

1．2．2 EPCs的分离、培养 小鼠胫骨及股骨骨髓通过密度梯度离心法分离单个核细胞，按5×105／cm密度放置预先包被fibronectin的细胞培养皿中，加入EBM－2培养基培养，培养基预先加入5%FBS和生长因子，4d后去除悬浮细胞，隔天半量更换培养基，倒置相差显微镜下观察不同时间点细胞形态。

1．2．3 EPCs的鉴定 双染色（Dil－acLDL，FITC－UEA－1）：细胞培养7d后，依序往培养瓶内加入Dil－acLDL及FITCUEA－1（10mg／L），观察上述培养细胞摄取 Dil－acLDL及结合FITC－UEA－1能力，同时结合 Dil－ac－LDL、FITC－UEA－1细胞为EPCs；EPCs表面抗原鉴定：培养7d的细胞洗涤、离心后应用流式细胞仪检测 CD34、CD133、CD31、Flk－1表面标志表达。

1．2．4 t－AUCB体外对EPCs归巢功能的影响 EPCs培养7 d后，上述不同浓度t－AUCB（0、1、10、50、100μmol／L）预干预24h，加入Dil－acLDL至上述细胞悬液，浓度为2μg／mL，避光孵育1h，显微镜下观察Dil－acLDL吸收情况；开胸呼吸机辅助下结扎冠脉左前降支，1h后经尾静脉注射上述干预的EPCs，24h后处死小鼠，按不同区域分为梗死区、边缘区、正常区，边缘区为距离梗死区5mm，将上述各区域心脏剪成小粒，消化离心，荧光显微镜下记数不同区域心肌消化后Dil标记阳性细胞数。

1．3 统计学处理 采用SPSS 17．0统计软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，并进行正态性和方差齐性检验，组间均数显著性检验用多个样本均数比较的方差分析（LSD－t检验），以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 小鼠EPCs的生长情况 刚接种时骨髓来源分离的单个核细胞呈圆形，散在悬浮于培养液内，24～48h后，部分细胞开始贴壁；4d后首次换液，去除培养瓶内未贴壁悬浮细胞，倒置相差显微镜下观察贴壁细胞生长状况（图1），细胞呈菊花状集落，中央为圆形细胞，周围为梭形细胞（图1A）；7d后，细胞集落明显扩大，集落中央圆形细胞逐渐向梭形细胞转化（图1B）；第8天可见细胞形成条索状（图1C）；第10天细胞可达80%～90%融合，以多角形、类圆形及梭形细胞为主（图1D）。

2．2 荧光双染色结果 荧光显微镜下观察小鼠骨髓来源EPCs摄 取 Dil－acLDL、结 合 FITC－UEA－1 能 力，摄 取 DilacLDL阳性细胞呈红色荧光，结合UEA－1阳性细胞呈绿色荧光，双阳性细胞呈黄色荧光，结果示95%以上培养的细胞呈双阳性黄色荧光：双阳性细胞为EPCs（图2）。

2．3 表面分化抗原流式细胞仪鉴定结果 流式细胞仪检测结果示：相较于同型分化抗原，小鼠骨髓来源EPCs各表面分化抗原 含 量 CD34 为 （53．89±0．34）%，CD133 为 （52．79±0．67）%，CD31 为 （36．67±0．93）%，Flk－1 为 （43．88±0．48）%，见图3。

图1 内皮祖细胞培养结果（×200）

图2 EPCs摄取Dil－acLDL及FITC－UEA－1荧光染色结果（×200）

图3 小鼠骨髓来源EPCs表面分化抗原流式细胞仪分析结果

2．4 t－AUCB对小鼠EPCs归巢功能的影响

2．4．1 心肌梗死模型制作 称重小鼠，戊巴比妥那50mg／kg腹腔注射麻醉，连接各心电图电极，正常心电图示S－T段在基线水平位置（图4A），小鼠气管插管后连接呼吸机，打开胸腔，剪开心包，暴露左心耳（图4C）结扎冠状动脉中1／3，结扎后可见心电图呈ST段弓背向上抬高（图4B），结扎远端心肌活动度减弱（图4D），心肌苍白后紫绀（图4E），表明模型制作成功（图4）。

图4 正常、梗死心电图形态及心梗模型制作过程中心肌演变过程

2．4．2 不同浓度t－AUCB对EPCs归巢至梗死心肌不同部位的影响 从0～100μmol／L t－AUCB干预组，随着浓度增加，t－AUCB可明显呈浓度依赖性增强EPCs归巢至梗死心肌边缘区、正常区及梗死区能力，与0μmol／L t－AUCB相比，1、10、50、100μmol／L t－AUCB可显著增强EPCs归巢至上述区域能力（P＜0．05），见表1。

表1 不同浓度t－AUCB干预对EPCs归巢至心肌不同部位的影响（x±s）

3 讨 论

EPCs从外周向心肌组织归巢为EPCs修复心肌梗死重要途径。观察t－AUCB干预对EPCs归巢的影响可发现：在梗死心肌边缘区，增加t－AUCB浓度，边缘区的EPCs明显增多，达数百个，并且呈浓度依赖性，提示t－AUCB促进EPCs归巢至梗死心肌边缘区；从0μmol／L至100μmol／L，t－AUCB可呈浓度依赖性增强EPCs向心梗边缘区归巢；在正常心肌区域，随着t－AUCB干预浓度变大，正常心肌组织的EPCs细胞数虽有增多（组间P＜0．05），但各组差异不大，只有数个细胞，且归巢至正常心肌细胞的细胞基数都不大，50个左右，提示在正常心肌，t－AUCB虽有作用，但明显减弱；计数梗死心肌细胞时作者发现：随着干预浓度逐渐增加，不同浓度t－AUCB干预的EPCs归巢至梗死心肌细胞数明显增加，各组之间比较差异有统计学意义（P＜0．05），但归巢的细胞数均少，最多只有30个左右。

分析原因：（1）t－AUCB对外周培养的EPCs激活对归巢具有刺激作用；（2）心肌方面，完整的心肌组织需要有完整的血管内皮，开通的血管及活动的血流，以利于EPCs向心肌组织归巢，此为EPCs顺利归巢的前提条件及重要影响因素。在梗死区，由于结扎冠脉中断血流，EPCs经静脉进入小鼠后不能随血流运行至梗死区；EPCs虽有迁移能力［11－13］，但心肌梗死后细胞肿胀、坏死，处于缺血缺氧环境，亦为EPCs向梗死心肌迁移提供障碍，心肌梗死后虽然有促进刺激EPCs归巢的细胞因子分泌［14－15］，但抑制EPCs归巢至梗死区的因素远远大于其促进因素，所以，经外周静脉注射的EPCs归巢至梗死区域的细胞数少，而大量聚集在梗死心肌边缘区域；在正常区域，虽然供应心肌组织的血流没有中断，但缺少促进EPCs归巢的细胞因子，所以，归巢的细胞数介于上述两区域之间。

综上所述，从0～100μmol／L，随着浓度增加，可溶性环氧化物水解酶抑制剂t－AUCB进行性增强其正向调控EPCs归巢功能。心肌梗死后归巢至正常区域及梗死区域内EPCs较少，正常区虽有差异，但差异较小，经t－AUCB干预的EPCs主要归巢至梗死心肌边缘区域。所以，在后继检测t－AUCB干预EPCs对梗死心肌的影响研究时，研究对象只选取最有代表性的边缘区，可明显增加实验的特异性及准确性。

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