血管紧张素Ⅱ协同LPS诱导巨噬细胞活化和凋亡的研究

李 妍，张宸豪，方 芳，王长文，陈 爽，李 强，赵良中，陈 为

（1.吉林医药学院检验学院，吉林 吉林132013；2.吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林132013；3.吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林132013）

血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）中重要的效应因子，与AngⅡ1型受体（AngⅡtype 1，AT1)结合可促进血管平滑肌收缩，参与血压调节[1]。单核巨噬细胞也表达AT1，在AngⅡ诱导后，其Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）表达增加；而TLR4与脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）结合可介导巨噬细胞活化信号转导[2]。理论而言，AngⅡ可促进LPS对巨噬细胞的活化，但活化的免疫细胞，往往通过活化诱导的细胞凋亡（Activation induced cell death/apoptosis，AICD）来减少自身的数量[3]。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型，来深入研究AngⅡ预处理对LPS诱导巨噬细胞活化和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠巨噬细胞RAW264.7冻存于液氮中。AngⅡ和LPS为Sigma公司产品；JC-1线粒体膜电位（Mitochondrialmembrane potential，MMP）检测试剂盒（产品编号C2006）、ROS荧光探针双氯荧光黄乙酸乙酯（Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)和pH值检测探针5-羧基荧光素,二乙酰甲酯（2'，7'-bis-（2-carboxyethyl）-5-（and-6）-carboxyfluorescein，acetoxymethylester，BCECFAM），购自上海碧云天生物技术研究所；1640培养液，购自Gibco公司；小牛血清，购自Hyclone公司；Annexin-V-GFP凋亡检测试剂盒，购自南京基凯生物技术有限公司；枣红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的抗小鼠TLR4抗体，购自Biolengend公司。

1.2 细胞培养和处理 含10%小牛血清1640培养液、5%CO2、饱和湿度和37℃下培养细胞，每周传代2到3次。接种细胞于培养瓶，加入AngⅡ（0，40，80 μg/mL和160μg/mL）后，培养24 h；AngⅡ（0或80μg/mL）处理细胞8 h后，加入LPS（0和4μg/mL），继续培养16 h。

1.3 TLR4表达分析 取5×105个细胞,悬于100 μL PBS，加入1μg PE标记抗TLR4抗体或阴性对照抗体，4℃下避光反应30min。PBS洗2次后用400μL的PBS重悬细胞，流式细胞仪检测PE荧光强度来代表TLR4表达变化。

1.4 活性氧检测 取5×105个细胞，PBS洗涤2次，100μL PBS重悬细胞，加入DCFH-DA储存液，至其终浓度为5μmol/L，混匀后在37℃避光反应30 min，PBS洗2次，400μL PBS重悬细胞，流式细胞仪分析。

1.5 细胞凋亡分析 取5×105个细胞，用PBS洗涤2次，取195μL结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin-V-GFP工作液，室温下避光反应30 min；结合缓冲液洗涤细胞2次，400μL结合缓冲液重悬细胞，流式细胞仪分析。

1.6 线粒体膜电位分析 取5×105个细胞，按说明书所述方法配制JC-1染色工作液和染色缓冲液（冰沐保存）。用500μL JC-1染色工作液重悬细胞，37℃避光反应30min；离心吸弃上清，染色缓冲液洗涤细胞2次；500μL染色缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪FL1通道（525 nm）检测细胞所发射的荧光。

1.7 细胞内pH值分析 取5×105个细胞，重悬于200μL PBS，加入DCFH-DA储存液至终浓度为2 μmol/L，37℃避光反应30min；PBS洗涤细胞2次；500μL染色缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪FL1通道（525 nm）检测细胞所发射的荧光。

2 结果

2.1 不同浓度AngⅡ对TLR4表达的影响 AngⅡ诱导24 h后，检测TLR4表达，结果表明，AngⅡ以浓度依赖的方式上调巨噬细胞TLR4表达（图1）。

图1 AngⅡ对巨噬细胞TLR4表达的影响

2.2 AngⅡ和LPS对巨噬细胞凋亡的影响 AngⅡ和LPS作用后，Annexin-V-GFP染色后分析细胞凋亡，与LPS单独作用比，AngⅡ预处理组细胞凋亡百分率显著增加（图2）。

图2 AngⅡ和LPS对巨噬细胞凋亡的影响

JC-1是一种新型荧光探针，进入细胞后，其存在状态和发射荧光与线粒体功能紧密联系。线粒体功能正常时，JC-1主要聚集在线粒体基质，形成聚合物，发射红色荧光；而在MMP较低时，JC-1主要以单体形式存在，发射绿色荧光。与对照组比较，4μg/mL的LPS单独作用后JC-1单体的荧光略下降，反映LPS可活化巨噬细胞并对线粒体功能有一定增强效应；虽然AngⅡ单独作用对MMP影响较小，但与LPS协同作用可导致线粒体功能显著下降（表1）。

表1 AngⅡ和LPS对巨噬细胞MMP的影响

2.3 AngⅡ和LPS对巨噬细胞ROS的影响 荧光探针DCFH-DA进入细胞后被酯酶水解为DCFH，继而被氧自由基氧化而生成DCF，检测DCF发射荧光的强度值可代表细胞内ROS水平。与LPS单独作用比较，AngⅡ和LPS联合作用，细胞内ROS显著增加（表2）。

表2 AngⅡ和LPS对巨噬细胞ROS的影响

2.4 AngⅡ和LPS对巨噬细胞内pH值的影响 接近中性时，BECEF可在被激发后发射绿色荧光（530 nm），其荧光强度随pH值升高而增强，荧光强度减弱则指示pH值下降。分析结果表明，与对照组比较，LPS或AngⅡ均可导致巨噬细胞pH值略下降；与LPS单独作用组比，AngⅡ和LPS协同作用组，细胞内pH值显著降低（表3）。

表3 AngⅡ和LPS对巨噬细胞pH值的影响

3 讨论

血管紧张素原在肾素和血管紧张素转化酶（Angiotensin-converting enzyme）的作用下被转换为AngⅡ，RAS通过AngⅡ与其受体AT1结合导致血管平滑肌收缩，调节血压平衡[1]。严重创伤、失血性休克、烧伤等急性应激情况下，AngⅡ主要体现其对机体的保护性作用。有学者报道，上述疾病合并感染，尤其感染革兰阴性菌后，内毒素对血管内皮的损伤作用严重；在创伤和烧伤等情况下，细菌感染还可导致肺损伤并危及生命[4-5]。体内和体外研究发现，AngⅡ和LPS可协同作用，参与血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的损伤。有学者将上述机体急性应激情况下，内毒素致病性加重的现象称为“二次打击”[6]。LPS上调血管内皮细胞AT1表达，及AngⅡ促进肺泡上皮等TLR4表达可能是形成该现象的重要原因。

微炎症（Microinflammation）是指以循环系统中炎性蛋白、炎症性细胞因子轻度升高为特征的低强度、慢性炎症状态。单纯微炎症没有明显临床症状，但常伴随糖尿病、慢性肾病和长期血液透析患者存在。导致微炎症的机制尚未明确，但血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）可能发挥重要作用。巨噬细胞在抗感染和炎症进程中的角色复杂，一方面其活化可增强吞噬病原体效应，另一方面活化巨噬细胞通过释放炎症介质，参与组织损伤。T细胞可通过活化诱导的细胞凋亡（Activation induced cell death/apoptosis，AICD）来减少自身的数量，近年来有学者报道，活化的巨噬细胞也发生凋亡和坏死[3，7]。体内有吞噬功能的细胞（巨噬细胞和嗜中性粒细胞）被活化后，其细胞内溶酶体活性增强，而细胞内pH值下降。虽然溶酶体活性增强有利于杀伤病原体，但在细胞死亡后溶酶体酶的释放往往导致正常组织损伤[8]。

TLR4结合LPS后可活化p38MAPK和NFκB等炎症相关的信号。本研究表明，AngⅡ以浓度依赖方式上调小鼠巨噬细胞TLR4表达，而在AngⅡ与LPS协同诱导后，细胞内ROS含量显著增加，pH值下降幅度也较LPS单独作用组大，即AngⅡ对LPS活化巨噬细胞具有曾敏作用。同时发现，AngⅡ与LPS协同诱导后，细胞凋亡和导致线粒体功能损伤的效应也增强了。概括而言，血管紧张素Ⅱ可协同LPS诱导巨噬细胞活化，两者联合也增加了活化后巨噬细胞的凋亡。活化巨噬细胞释放炎性介质和死亡巨噬细胞释放溶酶体酶，但均参与炎症急性期的组织损伤，因此，AngⅡ与LPS协同可导致体内发生严重的炎症相关的组织损伤。近年来，慢性微炎症状态下，巨噬细胞参与组织器官纤维化、动脉硬化等的证据引起人们重视。本研究表明，AngⅡ对巨噬细胞感应LPS刺激具有“预致敏”的作用，提示在机体急性应激和慢性的微炎症状态下，均应适当拮抗AngⅡ的“预致敏”作用以减轻内毒素的致病性。

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