猪博卡病毒（重庆株）NP1部分基因的克隆测序及生物信息学分析

叶星宇，聂 奎，聂福平

（1.西南大学动物科技学院，重庆 北碚400715；2.四川省广元市动物疫病预防控制中心，四川 广元628000；3.重庆市出入境检验检疫局，重庆 江北400020）

2009年，瑞典的Blomstroem等人从患PMWS病猪的淋巴结中分离得到一株新的细小病毒，将其暂命名为猪博卡样病毒（Porcine Boca-like Virus）[1]。随后，通过对其接近全长的基因组进行扩增和测序，证明了该病毒属于博卡病毒属，与犬博卡病毒的亲缘关系较近，因此正式命名为猪博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）[2]。目前在欧洲、北美、中国、中国香港已经有PBoV感染猪群的报道，并且PBoV在患病猪中的感染率高于健康猪中的感染率，因而推测PBoV可能与某些病原体起到协同致病的作用。但幸运的是，至今尚未见有PBoV感染人的报道。

研究证实，PBoV为单股线状DNA，其基因组大小为5.2 kb左右，包含3个开放阅读框，ORF1编码非结构蛋白（NS1），ORF2编码2个衣壳蛋白（VP1和VP2），中间开放阅读框（ORF3）编码一个高度磷酸化的非结构性蛋白质（Nuclear Protein 1，NP1）[3-4]。稳定的NP1基因为博卡病毒所特有，对于NP1遗传进化的研究有助于了解PBoV在国内猪群的流行的传染源以及其遗传变异规律，为PBoV的科学防控提供参考。本试验通过设计一对特异性引物，对重庆地区猪群中猪博卡病毒部分NP1基因进行克隆及遗传变异分析，报告于下。

1 材料与方法

1.1 血清来源 血液样本采自重庆市某规模养殖场，离心后分离血清，分装并置于-20℃冻存备检。

1.2主要试剂 DNA提取试剂盒、r Taq DNA聚合酶、DNA片段回收试剂盒、感受态细胞JM109、pMD19-T载体试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司；UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒，购自Omega公司；氨苄青霉素（Amp），购自Invitrogen公司。

1.3引物的设计 根据GenBank已公布的PBoV-NP1基因序列，利用DNAStar和Primer 5.0软件在其保守序列设计一对特异性引物。上游引物PBoV-F：5'-AAGGACATCTCCGAAAC-3'，下游引物PBoV-R：5'-ATGAATGCCAGTGAAA-3'，预计扩增片段大小为257 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.4 病原体DNA抽提和PCR扩增 按TaKaRa公司（大连）的病毒基因组提取试剂盒说明书，从猪血清提取病毒DNA。以提取的DNA样品为模板，进行PCR扩增，反应条件为：95℃5min；94℃30 s、56℃30 s、72℃60 s，共40个循环；72℃延伸10min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 PCR产物的克隆与测序 用DNA回收试剂盒回收PCR产物，与pMD19一T载体进行连接；将连接产物转化到大肠埃希菌JM109感受态细胞，37℃培养12 h，挑取上述转化平皿中的白色菌落，接种到含有Amp（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至混浊，提取质粒送宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.6 生物信息学分析 从GenBank获取已公布的PBoV序列及HBoV、PPV序列（见表1），并对本试验的PboV-NP1（CQRC1-7）基因序列与公布的PBoV基因序列及HBoV、PPV基因序列进行同源性比较和系统进化分析。

2 试验结果

2.1 NP1部分基因的克隆 用PCR方法扩增出PBoV-NP1部分基因片段，大小约为257 bp，与预期片段大小一致（图1）。

表1 本试验中用于PBoV系统进化分析的序列信息

图1 重庆地区部分猪血清样本PBoV的PCR检测结果

2.2 PBoV-NP1基因核苷酸序列分析

2.2.1 PBoV-NP1基因序列同源性比较 测得7个猪博卡病毒重庆株NP1部分基因片段序列，拟命名PboV-NP1（CQRC1-7）。测序结果显示，PboVNP1（CQRC1-5）及PboV-NP1（CQRC7）与PBoV瑞典标准株GU902968序列完全一致，PBoV-NP1（CQRC6）在NP1基因的第236位碱基及第269位碱基与GU902968仅有2个碱基不同（图2）。

CQRC1-7与PBoV瑞典株GU902968同源性为99.2%-100%，CQRC-6与CQRC1-5及CQRC-7仅有2个碱基不同，同源性为99.2%。CQRC1-7与其他PBoV瑞典株及中国株的同源性均在97.3%以上，CQRC1-7与HBoV瑞典株同源性仅为32.3%～34.6%，与PPV的同源性较低，表明本试验扩增区域内的基因较为保守（图3）。

图2 PBoV-NP1（CQRC1-7）与PBoV瑞典标准株NP1部分基因序列比对

图3 猪博卡病毒NP1部分基因同源性比较

2.2.2 PBoV-NP1基因遗传变异分析 PBoV-NP1（CQRC1-7）基因遗传变异分析结果显示，PBoVNP1（CQRC1-7）与HBoV st1株形成一簇，3株PPV NADL-2株与PPV中国株亲缘关系很近，但其与博卡病毒属成员的亲缘关系较远，所以这4株PPV聚在一起形成另一簇；PBoV-NP1（CQRC1-7）与GenBank公布的9个PBoV瑞典株及中国株在一个分支上，HBoV st1株单独形成一个分支；其中，PBoV-NP1（CQRC1-5）及PBoV-NP1（CQRC7）与PBoV瑞典株（GU902968）亲缘关系非常近，聚在一个分支上，PBoV-NP1CQRC6与PBoV-NP1（CQRC1-5）及PBoV-NP1（CQRC7）属于不同的分支。PBoV-NP1（CQRC1-7）与PBoV瑞典株及中国株在同一分支上，表明PBoV的NP1基因遗传变异较小（图4）。

图4 猪博卡病毒NP1基因发育进化树

2.3 PBoV-NP1基因氨基酸序列分析 PBoV瑞典株sw90_1株NP1基因推导，NP1蛋白全长218个氨基酸，本次试验获得的基因片段编码NP1基因第30位点至111位点的82个氨基酸，根据16株PBoV的NP1基因的核苷酸序列推导了其所编码的氨基酸序列。结果显示，各毒株氨基酸序列之间比较，共有10个位点的氨基酸发生了变异，同源性在87.8%～100%之间。

3 讨论

2010年，Blomstroem等发现了PBoV的一段编码218个氨基酸的开放阅读框，并证实为NP1基因，且与人类博卡病毒NP1基因序列相近，基因组两端具有2个分别编码NS蛋白和NP蛋白的开放阅读框NP1基因具有较好的稳定性，是成为疫苗和药物作用的良好靶点[5]。通过对本次试验分离的7个病毒株NP1部分基因的测序与分析，发现7个PBoV-NP1部分基因片段其与NCBI公布的PBoV序列同源性达到97.3%～100%，其中与瑞典标准株（GU902968）同源性最高，为99.2%～100%，表明重庆地区流行的猪博卡病毒可能与PBoV标准株的亲缘关系很近，推测重庆地区猪群中感染的PBoV可能是通过国外品种引进或者进口国外动物性产品而传播感染猪群,因此，应当加强国外引种及进口动物性产品的检验检疫，加强境岸检疫，防止特定病原传入国内。该试验也表明PBoV的NP1基因核酸序列可能比较保守，遗传进化速度较慢，与同科的其他病毒做遗传变异分析，形成相对独立的一个分支，为猪博卡病毒NP1基因功能的进一步研究奠定了一定的基础。

[1]Blomstrom A，Belak S，Fossum C，et al.Detection of a novel porcine bocalike virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postewaningmultisystemic wasting syndrome[J].Virus Research，2009，146：125-129.

[2]Blomstrom A，Belak S，Fossum C，etal.Studies of porcine circovirus type 2，porcine boca-like virus and torque teno virus indicate the presence ofmultiple viral infections in postweaningmultisystemic wasting syndrome pigs[J].Virus Research，2010，152：59-64.

[3]林峰，曾爱平，杨恩，等.WLL-1株博卡病毒（Boeavirus）全基因组序列分析[J].病毒学报，2007，23（1）：1-3．

[4]罗迪贤，刘巧突，林应标，等.人类博卡病毒基因组序列与进化分析[J].实用预防医学，2006，13（6）：1430-1432.

[5]曾松林.猪新型细小病毒PHoV和PBoV诊断方法的建立、分子流行病学调查及基因组序列分析[D].武汉：华中农业大学，2010：4-5.