生长激素受体激活剂和拮抗剂的研究进展及应用

杨艳红，兰海楠，付志玲，刘 禹，崔焕忠，吴天成，杨 欢，洪 盼，李雨萌，郑 鑫

（吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春130118）

生长激素受体(growth hormone recepter，GHR)属于I类细胞因子受体，是调节机体后天生长的主要因子，生长激素(growth hormone，GH)只有在与受体结合后，才能启动信号转导，参与调节机体的代谢、发育、繁殖以及免疫等生理功能[1]。由于分泌激素的异常性及需求性的不同，人们开始试图通过利用免疫学技术制备抗独特型抗体或抗受体单克隆抗体以及利用基因工程技术对天然GH分子进行改造的方法来改变与受体作用的活性或降低二者的结合力，寻求GHR的激活剂和拮抗剂。了解GHR激活的机制是合理设计受体激活剂和拮抗剂的关键。

1 生长激素受体的激活机制

GHR的激活机制一直都是人们研究的热点。GHR有胞外域、跨膜域和胞内域组成，其中胞外域具有两个亚域（亚域1和亚域2）。过去人们一直认为GHR是以单体形式存在于靶细胞膜表面，是GH诱导受体后使其发生二聚化，但是，现在有大量研究发现，GHR本身就是二聚体形式[2]。受体亚域2内含有二聚化接口，在这个接口处的氨基酸可以形成GH（GHR）2复合物中两个单体GHR间的非共价键[3]。脑垂体前叶分泌的GH与GHR以1∶2的比例结合后，二聚化接口处的氨基酸虽然对于激素结合的作用不大，但是对于启动信号转导却是必不可少的，可促进诱发后续信号转导激活性受体的形成，进而发挥其促进合成与代谢等生物学作用[3]。每个GH有两个GHR结合位点，这两个位点一个为高亲和性位点(Site 1)，由螺旋4近C端的一些氨基酸残基、螺旋1和螺旋2之间非螺旋的连接部分以及螺旋1近N端的少数几个残基共同组成，另一个是低亲和性位点（Site 2），由N端的一些残基以及螺旋3上的一些残基组成，两个位点与受体的结合是通过一种有序方式进行的，不能反向为之[4]。

如果一种抗体具有GH结合的两个位点或有与这两个位点相近的氨基酸组成，并且能够与受体结合，则有可能成为受体激活剂的一种；如果限制了其中一个位点的结合或者是与受体结合后不能诱导受体转换成激活受体的形式，也即不能诱导其发生能够引发信号转导所需的构象变化，则会限制GHR介导的生物学作用，成为GHR拮抗剂。

2 生长激素受体激活剂与拮抗剂的发展

2.1 生长激素受体激活剂的发展 GH部分或完全缺乏，或由于结构异常、受体缺陷等原因都会导致机体出现生长激素缺乏症（Growth Hormone Deficiency，GHD），GH缺乏的患者，生长发育迟缓，有的还会表现为侏儒症。比较理想的治疗方案是激素替代治疗，但是，因为GH的半衰期很短，这就要求替代治疗过程中每天都需要对病人进行注射GH。为此，人们开始对长效GH进行探索以减少替代治疗中的不便。其中的一种方法是诱导激素结合位点的关键氨基酸进行突变来增强激素与受体结合的亲和性来增加GH的生物活性。例如，用存在于hGH位点1上的氨基酸残基取代pGH位点1的残基后得到的激素其活性要比正常pGH的活性高5倍，但是未能改变其半衰期较短的问题[5]。将GH分子共价连接聚乙二醇后被证实可以延长激素的半衰期，对于GHD患者可由原来的每天注射改成每周注射，但是该方法降低了激素的活性[6]。于是，缓释长效激素分子吸引了众多目光，当前研究比较多的药品有Nutropin Depot和Biosphere，但是疗效不明显现在也已经停产[1]。

除了改变激素本身来提高GH的活性外，利用免疫学方法寻找长效受体激活剂也一直受到国内外研究者的青睐。其中一种方法是制备GH的抗独特型抗体，由于GH的抗独特性抗体具有2个相同的抗原结合位点，因此可以同时与2个GHR结合，启动信号转导，如猪生长激素抗独特型单克隆抗体（CG1）[7]。另外一种方法是用GHR免疫Balb/c小鼠获得抗GHR单克隆抗体mAb263，据报道，每天给垂体切除鼠注射200μg的mAb263与注射3μg hGH/d对鼠的增重效果是相近的，可见mAb263具有模拟GH的作用，同时mAb263还能够诱导受体发生与GH刺激相近但是不一致的受体构象变化。mAb263是一种构象敏感型的激活性抗体，与GHR ECD亲和性很高，其表位残基不连续的结合到靶细胞膜受体亚域1上，主要分布在D-E带以及二者间的β环状肽内（见图1），结合后诱导受体亚域2及胞内域发生特定的构象变化，进而决定信号转导通路的选择方向[8-9]。

2.2 生长激素受体拮抗剂的发展 受体拮抗剂的研制与开发主要基于两点：（1）通过抑制生长激素与受体结合，进而抑制生长激素介导的信号转导而封闭其生理作用，这种抑制剂的开发着力点是研制无活性的生长激素类似物；（2）通过抑制生长激素诱导的信号转导，这种技术方法并不抑制生长激素与受体结合，而是主要通过抑制受体的构象变化，进而使生长激素不能发挥其生理活性，这种抑制主要是靠生长激素受体的抗体而实现的。

通过对hGH和bGH的比较研究发现，bGH的117、119位和122位氨基酸并未能排列成一个理想的α螺旋,它们所组成螺旋3的多肽具有明显低的促生长活性，所以产生了合成理想螺旋3来生成高活性的GH类似物的想法[10]。于是出现了表达有bGHM8（GH的螺旋3基因发生突变，一种GH模拟物）的转基因小鼠，但是这种小鼠表现为侏儒鼠，还有低循环的胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factorI，IGF-I)，并且在体外bGH-M8还会抑制125I-bGH与肝细胞膜的结合，综合这些症状可见bGH-M8实际上是一种GHR的竞争性拮抗剂，这也是报道最早的受体拮抗剂[10]。转基因动物模型同时也证实了如果将GH分子的一个氨基酸取代后，GH分子就能从一个模拟物转变成为受体拮抗剂。bGH分子的119位甘氨酸残基相当于hGH分子螺旋3的120位甘氨酸残基，这个氨基酸残基对于GH的生物活性是很重要的。hGH G120K和hGH G120R是将120位甘氨酸残基分别被赖氨酸残基与精氨酸残基替换后所得到的GH激素类似物，这种类似物的位点1与受体结合紧密抑制位点2的结合，使得类似物能够与受体结合但是不能激活受体相关的构象变化，促生长活性减弱，产生拮抗hGH的作用。但是由于两者的半衰期都很短（约30min）不能直接应用，于是研究者又改动了hGH G120K结合位点1内很重要的8个位点的氨基酸，并将其与聚乙二醇（PEG，相对分子量为5 000）结合后形成PEG-hGH G120K（B2036 PEG），即培维索孟（pegvisomant）[11]。培维索孟是第一个用于临床治疗肢端肥大症的GHR拮抗剂[12]。

除了从配体的角度对拮抗剂进行研究以外，另一种比较成功的拮抗剂方案是从受体的角度来寻求受体拮抗剂。如抗GHRmAb18.24会通过识别受体亚域2而不能识别受体亚域1，阻止配体与受体结合进而抑制受体的激活，从而抑制体外试验中GH依赖性细胞增殖和体内肝细胞GH信号转导[13]。另一个单克隆抗体mAb5它能够抑制生长激素诱导的受体构象变化，使生长激素只能通过一个位点结合到生长激素受体上，致其不能进行信号转导，因此mAb5单克隆抗体在研究生长激素受体激活机制的研究中，受到广泛应用[2]。

3 生长激素受体激活剂和拮抗剂的应用

3.1 生长激素受体激活剂的应用 GH广泛的生理作用，对畜牧业生产有重要的经济意义。当机体GH分泌量很少的时候，如果额外施加GH，虽然会增加动物的生长，但是会引起内分泌失调、精神异常等一系列负面影响。目前，GH缓释制剂并不具有给药次数少，避免注射带来的痛苦等特点。由于受体单克隆抗体的研究发现，使人们明白应用特异性抗体可以改变动物原有的生理学模式，例如，孕酮抗体可以防止动物妊娠等，生长抑素抗体可以增加垂体对GH的合成与分泌,抗脂肪细胞膜蛋白抗体可以减少动物脂肪沉积，针对GH特异性表位以及GH抗体的抗体可以增强或模拟激素功效等[14]。mAb263作为一种可以与受体结合的商业化抗体，在给小鼠注射后还没有发现异常反应，但是由于其作为受体激活剂的活性要比hGH弱的多，且mAb263会不会诱导产生特异性信号路径还都是未知，使得在当前mAb263大部分还都只是应用于试验阶段，将其作为鉴定受体的工具或者是试验进程中的阳性对照使用，并未进行生产实践上的使用。

3.2 生长激素受体拮抗剂的应用 机体GH分泌量过多一直也是医学上难以解决的问题。通过手术、放疗等减少激素分泌量的传统方法效果并不理想，内科药物如多巴胺兴奋剂溴隐停及应用较广泛地SMS也因其众多的副作用而限制了其临床应用[11]。商品名为Somaver的Pegvisomant，是当前惟一一种首次获得欧盟批准可以应用于临床治疗的新一代GHR拮抗剂药物[11]。在一项验证Pegvisomant治疗肢端肥大症疗效的研究中发现，对112例患者进行为期l2周的随机双盲、安慰剂对照的试验，所有患者血清IGF-I基线水平均达到年龄相关的参考值上限的130%以上，且Pegvisomant治疗的患者中血清IGF-I呈现剂量依赖性下降，皮下注射10mg、15mg和20mg Pegvisomant的三组受试者中，随着注射剂量的增加血清IGF-I水平恢复正常水平的个体数也相应的会增加，20mg组可以使89%的个体血清IGF-I水平降至正常[15]。同时，Parkinson等[16]还发现使用Pegvisomant可以使肢端肥大症患者骨转换指标降至正常水平，从而改善由肢端肥大症所引起的代谢性骨病和骨质疏松症等。

此外，van der Lely通过对152名患者平均接受Pegvisomant治疗18个月的临床试验发现，其中有90%的病人治疗12个月后IGF-l为正常水平[15]，同时，Muller等[10]还发现在长期治疗过程中GH分泌水平大幅增长，而且，Pegvisomant能潜在地抑制硬脑胞膜瘤、结肠癌、乳腺肿瘤的生长。还有相关报道说通过转基因小鼠可以证实Pegvisomant能够防止肾小球硬化等[17]。由于Pegvisomant和细胞膜上二聚化受体的亲和力只有hGH的1/40，所以要加大Pegvisomant的浓度才能对hGH起到拮抗作用。

4 展望

随着科学技术的进步，人们不会停止对于治疗激素缺乏或者过剩等疾病的脚步。由于GH抗独特型抗体两个位点的同一性还不能够完全等价于GH这种柔性不对称的蛋白分子，能够模拟激素多种功能的mAb263由于其活性的过低性，没有得到广泛应用，但是如果从mAb263可以诱导受体发生与激素刺激相近但不一致的构象变化来看，其诱导产生的信号转导通路可能与激素介导的也不完全一致，也许mAb263能够作为特异性信号通路的激活因子也是未可知的。生长激素受体拮抗剂中比较成功的典例是培维索孟，它可直接作用于外周GHR，阻止其形成功能性二聚体，减少后续的信号传导，可使肝脏和其他组织合成IGF-1减少，有效改善肢端肥大症患者临床症状及代谢紊乱。培维索孟半衰期长，在阻断GH的作用和降低血清IGF-1水平的作用上效率高、起效快，但是其临床长期使用的安全性尚未得到全面评估。

[1] Yahia A.Kaabi.Growth hormone and its receptor：A molecular insight[J].Saudi Journal for Health Sciences，2012，1：61-68.

[2]Ross R JM，Leung K C，Maamra M，etal.Binding and functional studies with the growth hormone receptor antagonist，B2036-PEG（pegvisomant），reveal effects of pegylation and evidence that itbinds to a receptor dimer[J].Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism，2001，86（4）：1716-1723.

[3] Jiang J，Wang X，He K，et al.A conformationally sensitive GHR[growth hormone（GH）receptor]antibody：impact on GH signaling and GHR proteolysis[J].Molecular Endocrinology，2004，18（12）：2981-2996.

[4] 贺淹才.生长激素和生长激素受体的分子生物学[J].生命的化学，2002，22（1）：29-32.

[5] Wan Y，McDevitt A，Shen B，etal.Increased Site 1 Affinity Improves Biopotency of Porcine Growth Hormone EVIDENCE AGAINST DIFFUSION DEPENDENTRECEPTOR DIMERIZATION[J].Journal of Biological Chemistry，2004，279（43）：44775-44784.

[6]Rasmussen M H，Jensen L，Anderson TW，et al.Multiple doses of pegylated long-acting growth hormone arewell tolerated in healthy male volunteersand possess a potential once-weekly treatment profile[J].Clinical endocrinology，2010，73（6）：769-776.

[7]兰海楠，李维，郑鑫.猪生长激素抗独特型抗体的制备及生物活性检测[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2012，40（011）：7-12.

[8] Wan Y，Zheng Y Z，Harris JM，et al.Epitope map for a growth hormone receptor agonistmonoclonal antibody，MAb 263[J].Molecular Endocrinology，2003，17（11）：2240-2250.

[9] Rowlinson SW，Yoshizato H，Barclay J L，et al.An agonist-induced conformational change in the growth hormone receptor determines the choice of signalling pathway[J].Nature cell biology，2008，10（6）：740-747

[10]Muller A F，Kopchick JJ，Flyvbjerg A，et al.Growth hormone receptor antagonists[J].Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism，2004，89（4）：1503-1511.

[11]郑琪蓉，苏青.生长激素受体拮抗剂培维索孟的作用机制和临床应用[J].上海交通大学学报，2008，28（1）.

[12]李乃适.培维索孟治疗肢端肥大症[J].临床内科杂志，2008，25（9）：584-586.

[13]Jiang J，Wan Y，Wang X D，et al.Inhibitory GH Receptor Extracellular Domain Monoclonal Antibodies：Three-Dimensional Epitope Mapping[J].Endocrinology，2011，152（12）：4777-4788.

[14]Wang B S，Lumanglas A L，Bona C A，et al.Functional characterization ofmonoclonal antibodies specific to growth hormone receptor[J].Molecular immunology，1996，33（15）：1197-1202.

[15]van der Lely A J，Hutson R K，Trainer P J，et al.Long-term treatment of acromegaly with pegvisomant,a growth hormone receptor antagonist[J].The Lancet，2001，358（9295）：1754-1759.

[16]Parkinson C，Kassem M，Heickendorff L，et al.Pegvisomant-induced serum insulin-like growth factor-I normalization in patients with acromegaly returns elevated markers of bone turnover to normal[J].Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism,2003，88（12）：5650-5655.

[17]Meinhardt U，EbléA，Besson A，etal.Regulation of growth-hormone-receptor gene expression by growth hormone and pegvisomant in human mesangial cells[J].Kidney international，2003，64（2）：421-430.