新型猪瘟疫苗的研究进展

张 双，郭 慧，徐 浩，孟繁星，胡桂学

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，严重危害养猪业。目前用来防治猪瘟的疫苗主要是中国猪瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE-疫苗和法国Thireval 疫苗[1]。在我国，猪瘟弱毒疫苗的应用一定程度上控制了该病的暴发与流行，但是目前尚没有方法可以区别猪瘟疫苗免疫抗体和野毒感染抗体，猪瘟的隐性感染和散发仍然严重影响我国养猪业。因此，现有的传统疫苗已不能适应新形势的需要，研究和开发新型猪瘟疫苗是未来研究的方向。近年来，分子生物学技术的迅速兴起和发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发奠定了基础。

1 亚单位疫苗

亚单位疫苗（subunit vaccine）是将编码病原微生物的保护性抗原基因导入受体菌或细胞，使其在受体中高效表达保护性抗原蛋白，将此抗原蛋白与佐剂联合制成的一类疫苗。亚单位疫苗是病毒粒子的一部分，不含核酸，具有良好的安全性和稳定性，但亚单位疫苗的免疫原性通常较低，需要与佐剂联合使用，或偶联到适当的载体上应用。CSFV编码的E2 和E0 蛋白是其主要保护性抗原，均能独立诱导机体产生中和抗体，保护机体免受强毒攻击。E2 亚单位疫苗是最早投入使用也是目前惟一投入使用的亚单位疫苗。

荷兰学者将CSFVE2 基因与核型多角体病毒（AcNPV）重组，并在昆虫细胞Sf21 中成功表达，免疫20 μg 表达的E2 蛋白可以保护被免疫猪免受强毒的攻击。在克隆猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2和Erns 的基础上，开发出了猪瘟的亚单位标记疫苗及与之相配套的诊断试验。初步检验结果显示，这种E2 疫苗和配套的诊断试验具有较好的效果。2009 年台湾研究者利用巴斯德毕赤酵母系统成功的表达重组E2 蛋白，并在其后的动物试验中也取得了成功[2]。另外，E2 蛋白上的中和表位在猪瘟病毒毒株中是保守的，因此在E2 蛋白基础上开发的亚单位疫苗不仅具有对抗CSFV野毒株的广泛保护作用，而且很容易通过检测抗Erns 的抗体将免疫的和感染的猪区分开[3]，因而具有广阔的应用前景。

亚单位疫苗虽然具有良好的个体保护效果，但其接种动物血清中的E2 抗体滴度上升较慢，也不能阻止CSFV的水平传播[4]。另外，接种动物血清中的Erns 抗体在接种后短时间内无法达到可检水平，这为配套的抗体鉴别检测造成了很大的局限。目前，国内外许多机构正在研究改进CSFV亚单位疫苗的佐剂以及配套的ELISA检测，已取得了一定的进展。

2 合成肽疫苗

利用DNA重组技术，根据CSFV基因组的核苷酸序列，可推导出CSFV蛋白质的氨基酸序列，从而可用人工合成方法制备其主要抗原相应的寡肽，制备猪瘟合成肽疫苗[5]。Zhou Y J等[6]报道，合成5 段猪瘟石门株B/C区693～777 位氨基酸，偶联BSA制成合成肽苗，结果免疫猪能产生高滴度的抗体，并能完全保护强毒的攻击。以此多肽制备高免血清，此血清1∶4 和1∶6 稀释后能抑制C株的兔体热反应，而用合成多肽对高免血清进行亲和层析处理后，则不能抑制C株的兔体热反应。

许多研究结果表明，猪瘟合成肽疫苗免疫后所起的免疫保护作用不是很理想，而且构建合成肽疫苗的抗原性及其免疫原性要受到其自身组成、猪体免疫系统等多种因素的影响。在诱导机体产生免疫的过程中，单一的中和抗原表位是不够的，增加中和抗原表位的数目和引入细胞抗原表位将起到辅助协同作用。若要提高合成肽疫苗的免疫效果，需要在探究合成肽疫苗的免疫机理，利用有限的抗原表位诱导强有力的免疫保护作用等方面做进一步的研究。

3 基因缺失型弱毒疫苗

通过基因工程技术使病毒基因组中的毒力基因缺失，可以获得基因缺失型弱毒疫苗株。Widjojoatmodjo MN 等[7]建立了能够表达猪瘟病毒糖蛋白Erns 的细胞系SK-6c26，构建了两个Erns 缺失突变株Flc23 和Flc22，经检测证明SK-6c26 所产生的Erns 蛋白和其他猪瘟病毒Erns 蛋白具有相同的生化特性，分别用两个突变株免疫试验猪，均可抵抗致死量猪瘟病毒强毒的攻击，而且Erns 的缺失可用于感染猪和免疫猪的鉴别。Yang Z 等[8]构建了3 个E2 基因缺失的感染性DNA，这3 个缺失突变株均不能产生活病毒，表明E2 的每一个抗原区对猪瘟病毒的生存都是必要的。但是这些缺失突变株接种猪后，均会产生不同程度的免疫作用，用血清学试验可以区别于正常毒株。Ruggli N 等[9]使用鼠的泛素来替换CSFVNpro 基因,分别在强毒株Alfort/187 和Eystrup 的基础上，构建出了2 个稳定的CSFV弱毒株。试验动物在接种一次弱毒以后能够抵抗强毒株Eystrup的攻毒。但Npro 蛋白在感染动物体内产生的抗体并不能达到ELISA检测水平，所以Npro 基因缺失株必须同时进行额外的修饰来达到可鉴别的目的。

以上研究说明，基因缺失型弱毒疫苗可能是发展猪瘟新型疫苗的有效途径之一，采用此方法会制造出免疫原性好、安全性高的弱毒疫苗株。

4 活载体重组疫苗

猪瘟病毒活载体重组疫苗是将CSFV的目的基因用重组DNA技术克隆到活的载体病毒中制备的一种疫苗，可直接用这种疫苗经多种途径免疫猪。目前用于表达外源性病毒蛋白的载体包括伪狂犬病病毒（PRV）、痘病毒（VAC）和腺病毒（ADV）等[10]。

4.1 伪狂犬病病毒载体疫苗 重组PRV能保持良好的抗原性、毒力不返强、对人无传染性、易于与野毒区别[11]。目前，PRV基因缺失疫苗株多通过缺失gE、gI、gC、gG、TK 等非必需基因来实现。Lee K S[12]等构建了能表达CS2FVE2 蛋白的gD、gE 双缺失的伪狂犬病病毒重组疫苗，免疫接种试验表明，该活载体疫苗能使猪获得对伪狂犬病和猪瘟的双重保护。路明华等[13]将SV40 启动子控制下的Lac Z 报告基因的表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有CSFVE2 基因及PRRSVGP5 基因的表达盒插入到PRVBartha-K61 株TK 基因中，Western blot 和间接免疫荧光试验证实E2、GP5 基因在重组病毒感染细胞中获得表达。

4.2 痘病毒载体疫苗 痘病毒的宿主范围较广，毒性弱，而且其基因组较大，可插入大片段的外源基因，同时能表达多个目的基因，各基因的表达互不干扰，遗传稳定。使用痘苗病毒作为载体，插入E2 基因，并缺失胸腺激酶（TK）基因获得毒力降低的重组痘苗病毒，免疫猪后可以保护猪免受CSFV强毒的感染。李谱华等[14]选择鸡痘病毒作为载体，将CSFV石门株的Erns 和E2 基因克隆入鸡痘病毒表达载体FPV-P11 中，成功构建了重组鸡痘病毒，免疫猪后用100 LD50的强毒进行攻击，结果显示，免疫猪保护率达到75%。目前，一些新的高度致弱的痘苗病毒载体被开发出来，具有较高的生物安全性，在猪瘟新型疫苗的研究中具有很大的潜力。

4.3 腺病毒载体疫苗 腺病毒只感染猪，毒力低，高滴度制备，易纯化，是一种很好的活病毒载体。CSFV的E2 基因重组ADV疫苗，可以保护猪抵抗强毒攻击，且攻毒后无任何临床症状，剖检无任何病理变化[15]。孙元等[16]将CSFV的石门株E2 全长基因片段，定向克隆到重组腺病毒AdEasy-1 系统的穿梭质粒pShuttle-CMV上，成功包装出重组腺病毒rAdVE2，分别在兔体和猪体上进行动物试验，结果显示试验中的兔体未出现定型热反应，接种rAdV-E2 的试验猪则能完全抵抗CSFV石门株强毒的攻击。

目前活载体重组疫苗的安全性和实用价值仍有争议，因为人类至今还不了解病毒的自然发生及变异机制，也就无法控制这类人造病毒的未来走向。一旦将该病毒放入自然界中，重组疫苗载体株与其他弱毒疫苗或野生毒株之间的异常遗传信息交换，同源或非同源重组后会产生携有外源基因的强毒性突变株，有可能改变其生物学特征，衍变出对人、兽有害的病毒变种，这还需要做深入细致的研究。

5 核酸疫苗

用猪瘟病毒E2 蛋白基因的表达载体可直接作为免疫猪体的核酸疫苗，该疫苗既可以诱导体液免疫，也可诱导细胞免疫，是近年来猪瘟病毒免疫研究的热点。

核酸疫苗虽然起步较晚，但在猪瘟疫苗领域取得了很大的进展。Hammond 等和Andrew等分别构建了表达CSFVE2 基因的重组质粒，并证明了对猪具有较好的保护作用。周鹏程等实验证明，针对CSFV5'端非编码区NS3 蛋白丝氨酸蛋白酶功能区的寡聚核苷酸对CSFV复制均有显著的抑制作用，这种特异性的寡聚核苷酸有可能成为抗CSFV的新型药物或DNA疫苗。李娜等[17]构建了基于甲病毒SFV复制子的DNA疫苗PSFV1CS-E2，随后的兔体交换试验和猪体攻毒保护试验均显示了良好的免疫保护效果。

DNA疫苗免疫的最大优点是能在同一时间，通过质粒携带的编码不同病毒抗原基因进行免疫，若同时将编码细胞因子的基因插在质粒上，不但可以提高免疫反应，而且可以调整反应从Th1 向Th2 型反应过渡。另外，DNA疫苗还可有效排除母源抗体的干扰。如果能够解决和改进核酸疫苗潜在的安全性和接种方法，CSFV核酸疫苗会为猪瘟疫苗研究领域注入新的活力。

6 全长感染性cDNA标记疫苗

全长cDNA标记疫苗是在分子水平上，将具有选择性标记的基因替换或克隆到致弱病毒全长cDNA中，获得的重组病毒，免疫动物后经过检测，可以区分抗体来自于自然感染还是标记疫苗免疫，从而鉴别出感染猪群和免疫猪群[18]。

2000 年，De Smit 等利用CSFV疫苗毒株、中国C株的基因组DNA拷贝构建了2 个重组CSFV（Flc2、Flc3）。试验表明，重组病毒在兔和猪中保留了父代C株的生物学特性和免疫原性，C株全长cDNA可作为基质以开发活的重组CSFV标记疫苗。2001 年，De Smit 等[19]将疫苗株重组病毒的E2 和Erns 部分序列分别用BVDV相应区段替换构建了2 个镶嵌病毒，在免疫1～2 周后，即可对猪产生较好的保护作用。经重组病毒接种的猪，可以抵抗致死剂量猪瘟病毒的攻击，即使不能诱导中和抗体的重组子也可产生保护性的免疫力。2010 年，J.Kortekaas 等[20]对CSFV全长感染性cDNA疫苗进行了研究，证明E2 结构蛋白A区是猪瘟特异性ELISA鉴测的主要靶目标，通过改进后的疫苗可有效地区别自然感染猪群与疫苗免疫猪群,为建立快速、准确的CSFV诊断试剂盒奠定基础。

CSFV全长感染性cDNA标记疫苗的最大优点是带有可识别的标记，诱导抗体能与野毒诱导的抗体相区别，为建立快速、准确的CSFV诊断试剂盒奠定基础，便于及早发现感染动物并采取控制措施，也可在实施猪瘟“扑灭计划”时减少大量错杀导致的经济损失。

7 小结

随着兽医生物技术研究的不断深入，CSF 新型疫苗也随之不断发展。虽然CSF 新型疫苗取得了一定进步，但各种备选疫苗都还存在一定缺陷，比如免疫原性、配套DIVA（differentiating infected from vaccinated animals）血清学检测、抗体效价以及造价等，阻碍了其投入应用的进程。因此新型猪瘟疫苗的研究不仅是开发新的具有可行性的标记疫苗设计方案，更重要的是要逐步解决已有备选标记疫苗的优化问题，使其能够真正形成商品化产品，用来有效控制和预防猪瘟的暴发。此外，研究疫苗联合免疫策略也会起到增强免疫效果的作用，也是今后猪瘟疫苗研究的一个重要方向。相信良好的免疫效果结合综合防控的措施，最终能达到控制并消灭猪瘟的远大目标。

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