杆状病毒囊膜蛋白介导病毒侵染宿主细胞中的作用

宋振辉，封海波，张鹦俊

（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460；2.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；3.西南大学荣昌校区图书馆，重庆 荣昌 402460）

杆状病毒（Baculovirus）是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，在分类学上属于杆状病毒科（Baculoviridae），其宿主主要包括鳞翅目（Lepidoptera）、膜翅目（Hymenoptera）和双翅目（Diptera）昆虫。基于杆状病毒全基因组序列构建的系统进化树，将杆状病毒科划分为4 个属：Alpha 杆状病毒属（以鳞翅目昆虫为特异宿主的NPV），Beta杆状病毒属（以鳞翅目昆虫为特异宿主的GV），Gamma杆状病毒属（以膜翅目为特异宿主的NPV）以及Delta杆状病毒属（以双翅目为特异宿主的NPV）[1-2]。目前，广泛用于携带外源基因表达的杆状病毒仅限于核型多角体病毒（NPV）。该病毒在它的生活史上会形成两种形式：包埋型病毒粒子（occlusion derived virus，ODV）和出芽病毒粒子（budded virus，BV）。病毒感染宿主细胞早期，主要产生病毒粒子BV，到了感染晚期，则BV减少，逐渐过渡到只产生ODV。因为这两种病毒粒子具有相同的核衣壳，不同的囊膜组成分，致使它们侵入宿主细胞的方式有所差异[3]，在自然界中，ODV介导口服感染，BV介导系统感染，BV可以转导哺乳动物细胞，但不能繁殖。近年来，许多研究人员致力于杆状病毒侵入宿主细胞的研究，对介导ODV口服感染的囊膜蛋白有了新的发现，对BV进入细胞的机制，特别是可转导哺乳动物细胞的种类进行了积极探索，本文就杆状病毒ODV和BV囊膜蛋白介导病毒侵染宿主细胞中的作用最新进展作一简要论述，希望为研究杆状病毒侵入细胞机理及其作为哺乳动物细胞基因传递载体提供参考。

1 杆状病毒ODV膜蛋白在侵染宿主细胞中的作用

ODV病毒粒子包括10 余种囊膜蛋白，其中6 种囊膜蛋白被鉴定为病毒口服感染昆虫幼虫的必需蛋白，分别为P74（PIF0、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4）和PIF5，在ODV感染过程中，除了PIF5 蛋白不作为PIF复合体的组份，其余囊膜蛋白之间通过非共价健相互作用以PIF 复合体的形式发挥功能[4]，3 种蛋白PIF1、PIF2 和P74 被证明在病毒粘附宿主细胞过程中具有重要作用，缺失3 种蛋白的任何一个将丧失病毒口服感染的能力。研究表明，PIF1、PIF2和PIF3形成稳定的复合体存在于AcMNPVODV病毒粒子的表面，此复合体能够抵抗2%SDS和5%β巯基乙醇在50 ℃条件下作用5 min，免疫共沉淀分析表明，PIF复合体具有一个稳定的结构，当PIF4 基因缺失时，PIF1、PIF2 和PIF3 始终能够形成稳定的复合体。但是，缺失PIF1、PIF2 或PIF3 将导致复合体的破裂，因此，稳定的PIF 复合体能够进一步的分成两种组成单位，即PIF1、PIF2 和PIF3 形成的稳定核心，然后PIF4 紧密地与这个稳定的核心结构结合。研究表明，由PIF1、PIF2、PIF3、PIF4 形成的复合体在杆状病毒口服感染的起始阶段具有重要作用[5]。P95 和P74（PIF0）也与PIF1-4 复合体松弛地结合，P95 被核心基因编码，除了在自身启动子和宿主肌动蛋白基因的驱动下能够表达外源基因，P95 还具有壳多糖结合能力[6]，可能调节ODV与围食膜或中肠上皮细胞的相互作用。P95可能是病毒体外感染的必需基因，因为缺失P95 的杆状病毒DNA不能产生感染性病毒粒子[7]，在多个包埋型核多角体病毒（MNPV）中，P95 被发现是BV和ODV的一种成分，但最近通过蛋白质组学分析在苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Ac-MNPV）BV结构蛋白中没有P95 的存在。在ODV感染过程中，Ac5、Ac68 和Ac108 被鉴定为病毒粒子口服感染的必需膜蛋白，通过基因插入缺失和变异的方法，证明此3 种膜蛋白可参与PIF 复合体的组成，但却为病毒复制的非必需蛋白[8-9]，关于Ac5、Ac68和Ac108 与PIF 复合体的相互作用方式及其在病毒感染过程的具体作用有待进一步阐明。

2 杆状病毒BV膜蛋白在侵染宿主细胞中的作用

杆状病毒BV是通过膜蛋白gp64 或F 蛋白与宿主细胞的未知受体相互作用，以内吞体的形式进入宿主细胞。在内吞体（endosome）低pH 值诱导下（pH＜5.5），使细胞膜构象发生改变引发BV包膜与内吞体膜的融合，从而释放核衣壳进入细胞质。研究表明，gp64 的糖基化修饰和三聚体蛋白的形成对于病毒的吸附和膜融合至关重要[10]。缺失糖基化位点的杆状病毒对昆虫细胞的吸附能力显著降低，破坏gp64 三聚体蛋白亚基间的二硫键也将抑制gp64 的融合活性。分子进化分析表明，核多角体病毒Ⅰ型如AcMNPV和OPMNPV膜融合蛋白为gp64，核多角体病毒Ⅱ型缺乏gp64的同源基因，具有膜融合F 蛋白，F 与gp64 蛋白在氨基酸序列上没有同源性，但与gp64 功能相似，也具有低pH 值诱导的膜融合活性。杆状病毒通过识别宿主细胞受体，以内吞作用进入胞内，这种方式不只限于昆虫细胞，AcMNPV同样能通过相同方式进入哺乳动物细胞。

杆状病毒BV进入哺乳动物细胞，可在合适的哺乳动物细胞启动子控制下表达外源基因。近年来，利用杆状病毒将抗原递呈给哺乳动物细胞已受到广泛关注和应用。不同动物来源的细胞，重组杆状病毒的侵染效率存在差异，已知杆状病毒可进入的宿主细胞系包括人源Huh7、HepG2 细胞、猪源肾细胞系CPK、FS-L3 细胞、鼠源原代肾细胞、CHO、BHK细胞、牛源MDB、BT 细胞及不同哺乳动物骨髓来源间充质干细胞（BMSC）等[11-12]。目前关于杆状病毒BV进入哺乳动物细胞的详细机理尚不清楚，现在普遍认为杆状病毒可能通过某种受体介导的内吞作用进入细胞，内吞泡中的低pH 值条件可诱导病毒包膜蛋白gp64 的构象发生变化，使膜融合区域暴露并与内吞泡膜融合释放出病毒核衣壳。

Duisit 等认为病毒与细胞之间的静电相互作用及细胞表面的硫酸乙酰肝素可能在此过程中起重要作用[13]。也有报道细胞表面的磷脂可能是杆状病毒囊膜蛋白gp64 的重要识别、结合位点，他们认为杆状病毒的gp64 蛋白可能识别哺乳动物细胞表面的某种特殊受体从而介导病毒进入细胞内[14]。实验表明，杆状病毒囊膜蛋白gp64 在吸附哺乳动物细胞和内体逃逸的过程中发挥着重要作用[15]。缺失gp64 基因的杆状病毒无法进入哺乳动物细胞，而高效表达gp64 蛋白的杆状病毒可显著提高报告基因在哺乳动物细胞中的表达效率，已知哺乳动物细胞表面的磷脂充当了gp64的“码头”，有利于病毒接触细胞，除此之外，宿主细胞中是否有与gp64 特异性结合的蛋白参与病毒进入细胞的过程还不明确。

目前，利用杆状病毒作为外源基因表达载体的研究报道日益增多，如在研究口服免疫疫苗方面，基于杆状病毒作为载体表达病毒样颗粒（VLPs），进而评价其免疫效果，不妨是一种良好的研究思路。本课题组利用杆状病毒为表达载体，在昆虫细胞内成功表达了猪传染性胃肠炎病毒样颗粒[16]，目前正在评价病毒样颗粒诱导机体黏膜免疫效果。总结国内外与我们应用杆状病毒构建病毒样颗粒的研究，都客观存在一定的不足，如VLPs 的表达量低、VLPs 的纯化困难，易于被胃肠道降解等。杆状病毒BV可以转到哺乳动物细胞，利用这一特性，实现杆状病毒经黏膜途径免疫机体，在宿主细胞内表达外源蛋白，进而激发机体黏膜免疫应答，将会避免以上的不足，值得进一步探讨。

3 研究展望

在杆状病毒ODV口服感染过程中PIF 复合体蛋白质之间的相互作用是必需的，以前的研究证明，PIF 复合体包括PIF1、PIF2、PIF3、和P74，最新研究揭示更多的PIF 组成成分，至于新发现膜蛋白与PIF 之间的相关作用关系及其在病毒感染意义，PIF 复合体的宿主受体，及其ODV进入宿主细胞过程中复合体的构象变化等还需进一步深入研究。利用杆状病毒BV可转导哺乳动物细胞这一特性，已有越来越多关于杆状病毒作为基因转移载体的应用报道，如在动物基因工程疫苗、基因治疗、病毒样颗粒的组装等领域中应用杆状病毒的研究日益增多，但目前还有亟待解决的问题，如杆状病毒敏感的哺乳动物细胞还有那些，以及杆状病毒进入哺乳动物细胞的机制等，相信这些问题的阐明，将为揭示杆状病毒侵入宿主细胞机理及其作为表达载体系统提供重要的理论依据。

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