牦牛源产肠毒素性大肠杆菌血清型和毒力基因调查

郝一妹，张焕容，2

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都610041；2.动物医学四川省高等学校重点实验室，四川 成都610041）

产肠毒素性大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起犊牛腹泻的重要病原菌。ETEC的致病过程是细菌依赖黏附素，在肠道内定居、繁殖，然后释放细菌毒素引起细胞坏死和肠道紊乱，进而导致急性腹泻[1]。黏附素、肠毒素、溶血素等是与其致病过程有关的致病因子[2]，某些血清型也与大肠杆菌的致病性有关。国外有关于大肠杆菌的O抗原血清型与肠毒素和黏附素类型之间关系的相关研究报道。本研究检测了分离自牦牛腹泻样品中的产肠毒素性大肠杆菌的血清型和毒力基因携带情况，为牦牛源产肠毒素性大肠杆菌病的预防和治疗提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 分离自川西北甘孜州和阿坝州腹泻牦牛粪便棉拭子的41株产肠毒素性大肠杆菌，及参 考 菌 株SWUN4598（HlyA、HlyE）、SWUN4608（HlyE、ehxA）由西南民族大学动物医学实验室保存；参 考 菌 株CVCC215（K99、STa、F4）、CVCC208（STa、987P）、CVCC196（K88、astA），购自中国兽医微生物菌种保藏中心。

1.2 引物的合成 根据相关文献[7-8]和GenBank上已公布的序列，设计了10种毒力基因引物。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 血清型鉴定 参考O抗原血清分型鉴定方法，鉴定41株牦牛源产肠毒素性大肠杆菌的血清型。

1.4 毒力基因PCR检测 参照文献中PCR反应条件，优化后对41株牦牛源ETEC的10种毒力基因进行检测。

2 结果

2.1 血清型鉴定 玻片凝集试验显示41株分离细菌中，有20种不同的血清型，分别为：O1，O4，O7，O15，O22，O26，O27，O28，O34，O36，O54，O56，O57，O74，O87，O96，O110，O133和O149，其中O1和O15为主要流行的血清型，均占定型菌株的20%（8/40）。定型菌株存在一定比例的常见致病性血清型：O1（8），O15（8），O22（1），O26（1）和O36（1），常见致病性菌株比例为47.5%（19/40）。有1株未能确定血清型。

2.2 毒力基因的分布 41株牦牛源ETEC菌株均含有K99基因，携带astA，ehxA，HlyA，HlyE，STa基因的菌株数分别为25，23，15，5，4。LT、K88、987P和F41在这41株菌中均未检测到。13株细菌拥有3个毒力基因，K99+astA+ehxA、K99+astA+HlyA和K99+HlyA+ehxA、K99+ehxA+STa分别有5、4、3株和1株。11株细菌有4个毒力基因，其中K99+astA+ehxA+HlyA有8株，K99+astA+HlyA+HlyE有2株，K99+ehxA+HlyA+HlyE有1株。有2株细菌有5个毒力基因，分别为K99+astA+ehxA+HlyA+HlyE和K99+astA+ehxA+HlyA+STa。

3 讨论

本试验对分离自四川甘孜州和阿坝州两藏区牦牛腹泻样品中的ETEC采用O抗原血清型鉴定，结果表明，样品中的ETEC存在多种血清型，O1和O15为主要流行的血清型。本试验结果与文献报道的牛源ETEC的流行血清型存在一定的相似性，也具有一定的差异性。

黏附素、肠毒素、溶血素是ETEC致病因子[3]。黏附素主要由K99、K88、987P、F41等菌毛基因编码，其中K99的分布最为广泛，且为牛、羊、猪等牲畜所共有[4]。本试验中，41株ETEC中均携带有K99菌毛基因，未检测到其他3种菌毛基因。溶血素基因虽为肠出血性大肠杆菌（EHEC）的靶基因之一[5]，但也存在于ETEC菌株[6]，Smith在1967年报道大肠杆菌的溶血性可遗传转移，试验结果显示，溶血性大肠杆菌的靶基因HlyA在本次鉴定的牦牛源ETEC中的携带率高达37%（15/41），与相关报道一致。astA基因主要分布在肠致病性大肠杆菌中[7]，在产志贺菌毒素大肠杆菌中有检出[8]，但在本试验的产肠毒素性大肠杆菌中也有检出，且检出比例高。本试验对牦牛腹泻样品中分离的ETEC的血清型和毒力基因的研究丰富了大肠杆菌的毒力基因研究的相关资料，为进一步研究牦牛源ETEC的致病机理和防治措施提供了一定的理论依据。

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