产肠毒素性大肠杆菌菌毛的研究进展

张培晏，刘 峻(.四川省广元市昭化区动物疫病预防控制中心，四川广元6S0；.四川省广元市昭化区青牛乡畜牧兽医站，四川广元6S069）

产肠毒素性大肠杆菌菌毛的研究进展

张培晏1，刘 峻2
(1.四川省广元市昭化区动物疫病预防控制中心，四川广元62S021；2.四川省广元市昭化区青牛乡畜牧兽医站，四川广元62S069）

产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）常引起仔猪腹泻，在世界范围内造成了严重的经济损失。ETEC的致病作用与其具有粘附性菌毛和肠毒素密切相关，ETEC菌株的菌毛可与宿主黏膜上皮细胞表面的相应受体结合，并在局部组织定居、繁殖和产生毒素，损伤小肠黏膜，使小肠吸收分泌功能失常而致腹泻。本文针对ETEC菌毛的生物学特性、表达条件、免疫原性等方面作一概述。

产肠毒素性大肠杆菌；菌毛；生物学特性；免疫原性

产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是猪的一种重要肠道病原菌，它能够引起仔猪黄痢、白痢和猪的水肿病。1967年，Koher、Smith等[1-2]指出，引起幼龄家畜腹泻的大肠杆菌主要是产肠毒素性大肠杆菌（ETEC），其发病率可达90%以上，病死率很高，有的可达100%。随着研究的不断深入，本病的发病机理、诊断和防治都有了很大的进展，但仍然是影响养猪生产发展的一大难题。本文就ETEC菌毛的生物学特性、表达条件、免疫原性等方面进行综述。

1 菌毛的生物学特性

大肠杆菌的菌毛对一定种类红细胞和相应宿主的肠细胞具有粘附作用。当其粘附于红细胞时能使红细胞发生凝集，且不被D-甘露糖抑制，这是一种甘露糖抵抗血凝反应（MRHA）。除9S7P无血凝性外，其余的均具有各自凝集一定种类红细胞的反应谱，即血凝谱，可借此来初步鉴别所分离的大肠杆菌的菌毛种类。菌毛的MRHA可被相应的抗体抑制，故又可用甘露糖抵抗血凝抑制反应（MRHI）来对其作出确诊。各种菌毛对肠上皮的粘附作用具有宿主特异性，并只能粘附于具有相应受体的特定动物的肠细胞上。如KSS只能粘附于仔猪的十二指肠段，K99和F41可粘附于初生猪、牛、羊的空肠，而9S7P只能粘附于仔猪回肠。通常一个动物的ETEC菌株只表达一种菌毛，但已发现有些菌株可同时表达两种或更多种菌毛，而且又发现了新的菌毛。

2 不同培养条件下的菌毛的表达

2.1 培养传代和培养温度对菌毛形成的影响 菌毛的体外表达受诸多因素的影响，其中培养传代和培养温度是一个重要的影响因素。在连续传代3次后，菌毛表达最好，而随着传代次数的延长，菌毛表达量有所降低。这可能是因为连续传代导致相应质粒丢失，进而导致菌毛表达的减少或消失。由于KSS、K99、9S7P的遗传决定子位于质粒上，在多次传代过程中一些质粒丧失，因而有可能不产生粘附因子。粘附因子F41的遗传决定子位于染色体上，但也受其基因表达程度的影响。Briton等[3]认为菌毛的表达具有相变性，这种相变是自发产生的，与培养条件密切相关。因而在培养温度的选择上，37℃是菌毛形成的最适温度，低于1S℃则不能形成菌毛，2S℃以下能形成少量菌毛。

2.2 培养基对菌毛形成的影响 用常用的营养肉汤、Minca培养液、EME培养液和LB培养液在37℃培养大肠杆菌，均可看到菌毛，但菌毛出现的时间各不相同。Minca培养液培养的大肠杆菌在24h后即可形成菌毛，培养72h后可形成致密菌毛；营养肉汤培养则需36h后才可看到菌毛，72 h后可形成大量致密的菌毛。另外，培养基中的某些成分也可抑制菌毛的表达，0.5%葡萄糖可抑制KSS菌毛的表达，丙氨酸能显著抑制9S7P的形成。

3 菌毛的提取及纯化

3.1 菌毛提取 目前常采用的提取大肠杆菌菌毛的方法[4]有：4℃万能混合器混合法；60～65℃水浴振荡法；4℃组织捣碎法；冰浴匀浆法；4℃高速搅拌法。贾静等[5]发现当菌悬液加热至60℃时，可使菌毛和菌体分离，有效地保证了所提取菌毛的数量和纯度，而且相对于操作繁琐的混合法、捣碎法以及冰浴匀浆法等，加热法更为简便、易于操作。

3.2 菌毛纯化 收获菌体的主要目的是要得到较纯的菌毛蛋白，可以通过高速离心分离菌体和发酵液，然后将离心所得菌体热激搅拌，使菌毛从菌体上脱落下来。在得到纯菌毛蛋白的过程中，需要对蛋白质进行盐析和透析。用紫外吸收法在2S0nm处测定菌毛蛋白OD值，将粗提出来的菌毛蛋白盐析，盐析后作透析处理。菌毛蛋白的纯度可用SDS-PAGE检测。

4 菌毛的抗免疫原性机理及作用

菌毛抗原是一种蛋白质，具有良好的抗原性，给机体免疫后能产生相应的菌毛抗体，对菌毛粘附型致病性大肠杆菌具有免疫作用。用菌毛抗原免疫怀孕母猪，抗体可通过母猪初乳和常乳中的菌毛抗体阻止菌毛粘附肠黏膜，从而使仔猪获得对大肠杆菌的被动免疫。也可以直接用菌毛抗体给幼畜口服，在肠道内中和菌毛抗原，使其失去粘附能力。菌毛的循环抗体在防止下痢上效果不大，只有经口免疫才能建立对下痢的有效局部保护。作用机理：菌毛抗原进入肠道后，先由淋巴上皮细胞（M细胞）捕获，再把抗原信息传递给下层的巨噬细胞和B细胞、T细胞，活化后的B细胞和T细胞循环全身，一部分回到肠黏膜表面定居，成为分泌型IgA的浆细胞和致敏淋巴细胞，建立起“黏膜局部免疫系统”，从而有效地对抗菌毛抗原在肠黏膜上皮细胞的粘附，阻止病原性大肠杆菌的异常繁殖。

最早被证明具有免疫作用的大肠杆菌菌毛是猪ETEC KSS抗原[6]，随后的研究者相继又证明了K99、9S7P、F41等动物源[7-S]和CFA-I、CFA-II等人源宿主特异性大肠杆菌菌毛疫苗对一些大肠杆菌病具有良好的免疫保护作用[9]。许崇波等[10]对动物初乳中的菌毛抗体进行分析，结果表明IgM的调理素活性最高，而起抗粘附作用的主要是IgG。

5 菌毛抗体疫苗的临床应用

近年来，国内外学者就卵黄抗体的研究和开发做了很多工作，认为鸡卵黄抗体是一种大量、丰富、方便的特异性抗体的来源。卵黄抗体亦称卵黄免疫球蛋白，是一种高效防治仔猪大肠杆菌性腹泻的生物制剂，利用蛋鸡生产特异性卵黄抗体具有可规模化生产、成本低、特异性抗体含量高及安全性好等优点。Marquardt等[12]先后报道了菌毛卵黄抗体对初生和断奶仔猪腹泻的防治效果。Jin等[11]的体外试验表明，经喷雾干燥的含抗KSS菌毛抗体的鸡卵黄粉能阻碍ETEC KSS与猪小肠黏膜的粘附。肖驰等[13]还比较了菌毛蛋白疫苗卵黄抗体和细菌疫苗卵黄抗体对仔猪大肠杆菌性腹泻的预防效果，结果表明两种卵黄抗体都有效，但菌毛疫苗抗体的效果更好；试验还显示卵黄抗体对仔猪黄痢的治愈率高于庆大霉素、土霉素和痢特灵。卵黄抗体经仔猪口服后有抗ETEC感染的作用，它能与特异性粘附素抗原结合，减少或阻断粘附素粘附到仔猪肠道乳膜上皮细胞的表面，使ETEC不能在小肠定居繁殖，阻碍肠毒素分泌，从而防止腹泻[14]。用特异性卵黄抗体防治仔猪大肠杆菌性腹泻，不会影响肠道正常菌群的生长繁殖，不存在抗药性和药物残留问题，同时避免了怀孕母猪因注射疫苗引起的应激反应或仔猪母源抗体水平不足而导致的免疫丧失等问题，是一种安全高效的生物防制剂。

6 小结和展望

关于ETEC菌毛蛋白的研究方法较多，且都有各自的优势，但也存在着一些不足。菌毛作为疫苗研制的理想候选蛋白质，用来制成疫苗免疫母猪，可使所产仔猪获得被动免疫，不受大肠杆菌的侵袭。现代分子生物学和免疫学的进一步发展为研制安全有效的ETEC多价疫苗提供了先进的理论和技术支持，加速了现存ETEC疫苗的完善和新兴ETEC载体、DNA、植物疫苗的发展。如新CFAs的发现提供了更多的抗原种类；ETEC基因组、蛋白质组的深入研究则提供了更多的减毒基因和抗原表位的选择；黏膜免疫调节机制的揭秘也定能为ETEC疫苗的发展开辟新的道路。

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Research Progress of Enterotoxigenic Escherichia Coli

ZHANG Peiyan1，LIU jun2
（1.Anima1 Disease Contro1 Center of Guangyuan Zhaohua District，Sichuan Guangyuan 62S021；2.Anima1 Husbandry and Veterinary Station of Qingniu Town in Guangyuan Zhaohua District，Sichuan Guangyuan 62S069，China）

Enterotoxigenic E.coli（ETEC）is a common factor that causing pig1ets diarrhea，ETEC strains sett1e in 1oca1 tissue，mu1tip1y and produce toxins by combining with corresponding receptors on epithe1ia1 ce11 surface，then causeng intestina1 mucosa damaging，the function of absorption and secretion unnorma1，and 1eads to diarrhea.This paper summarized the bio1ogica1 characteristics，expressing condition and immunogenicity of ETEC＇s pi1i.

Enterotoxigenic E.Coli；Pi1i；Bio1ogica1 characteristics；Immunogenicity

SS52.612

A

1001-S964（2016）01-0032-03

2015-0S-2S

张培晏（19S5—），男，四川剑阁县人，大学本科，兽医师，从事畜牧兽医工作。