索拉非尼对肝癌组织和癌旁肝组织中SDF1-α表达的影响

陆录　朱文伟　陈进宏　贾户亮

(复旦大学附属华山医院普外科，上海　200040)



·论著·

索拉非尼对肝癌组织和癌旁肝组织中SDF1-α表达的影响

陆录朱文伟陈进宏贾户亮

(复旦大学附属华山医院普外科，上海200040)

摘要目的：从基质细胞衍生因子1-α(stromal-derived factor 1-α，SDF 1-α)入手，研究索拉非尼致肝癌侵袭转移潜能增强的机制。方法： 用HCCLM3细胞株建立BALB/c裸鼠原位肝癌模型并分为索拉非尼组和对照组，每组6只。索拉非尼组建模后2周开始给予索拉非尼灌胃，剂量为30 mg/(kg·d)；对照组建模后2周用0.9%氯化钠液灌胃；给药4周后处死裸鼠。采用RT-PCR法检测两组裸鼠肝癌和癌旁肝组织中鼠源性炎性相关因子的mRNA表达；通过免疫组化染色检测肝癌和癌旁肝组织中SDF1-α的表达；采用Western blotting检测癌旁肝组织中SDF1-α的表达；采用ELISA法检测外周血中SDF1-α的浓度。结果：索拉非尼治疗可以使肝癌组织以及癌旁肝组织中鼠源性SDF1-α的mRNA表达增加。免疫组化及Western blotting检测发现，索拉非尼可明显上调肝癌及癌旁肝组织中SDF1-α的蛋白表达水平。ELISA结果显示，索拉非尼可使外周血中鼠源性SDF1-α的浓度升高。结论：索拉非尼治疗可明显上调肝癌组织和癌旁肝组织中SDF1-α的表达。

关键词肝细胞肝癌；索拉非尼；基质细胞衍生因子1-α；侵袭转移

基本项目：国家自然科学基金项目(编号：81101564;81472671)

肝细胞癌(简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一。目前，手术切除仍是治疗肝癌最有效的方法，但患者在确诊时大多已属晚期，不适合手术治疗[1]。索拉非尼(sora-fenib)是晚期肝癌患者的一线治疗药物[2]。然而，两项针对索拉非尼的Ⅲ期临床试验[3-4]均发现，索拉非尼对晚期肝癌可显著延长肿瘤进展时间和患者生存时间，但其延长的中位生存期不足3个月，疗效不满意。另有研究[5-7]发现，索拉非尼治疗肝癌虽抑制了原发癌但却同时促进了转移癌的生长。

肿瘤微环境在肿瘤的侵袭和转移过程中起非常重要的作用。基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)又称为趋化因子配体12(CXCL12)，SDF1-α是其一种主要的亚型。SDF1-α由成纤维细胞、炎性细胞、内皮细胞等基质细胞分泌，通过与其受体CXCR4结合而促进肿瘤生长[8]。本研究通过检测肝癌、癌旁组织中SDF1-α的表达水平，探讨SDF1-α在索拉非尼引起的肝癌侵袭转移潜能增强中所起的作用。

1资料与方法

1.1实验动物、细胞株及药物雄性BALB/c裸鼠，6周龄，体质量15~20 g，购自中国科学院上海药物研究所，饲养于25℃恒温的SPF级层流室，12 h光照和12 h黑暗交替，自由进食标准颗粒饲料及饮水。HCCLM3细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。索拉非尼购自德国拜耳医药公司。

1.2裸鼠原位肝癌模型的建立及给药方式无菌条件下，在裸鼠皮下注射1×107个体外培养的 HCCLM3 细胞。待3~4周皮下成瘤后，在无菌条件下取瘤体，浸入预冷的0.9%氯化钠液中，剪切为2 mm×1 mm×1 mm，备用。腹腔注射戊巴比妥(2.5 mg/kg)麻醉裸鼠，消毒手术野，以左肋缘下斜切口(长度约8 mm)进腹，将肝叶从切口取出，斜形切开肝表面，植入已备好的瘤块，用6-0缝线缝合肝切缘，用5-0缝线双层缝合腹壁和皮肤。术后2周开始给药，将400 mg索拉非尼溶于100 mL的溶剂(蓖麻油∶乙醇∶dH2O=12.5∶12.5∶75)中，给裸鼠灌胃，剂量为30 mg/(kg·d)。给药4周后处死裸鼠并取材。

1.3实验方法

1.3.1实时荧光定量PCR检测SDF1-αmRNA表达用TrIzol提取肝癌及癌旁肝组织的RNA，按照逆转录试剂盒[宝生物工程 (大连) 有限公司]的说明书将其逆转录为cDNA。用宝生物工程 (大连) 有限公司的SYBR Premix Ex Taq II试剂盒进行荧光定量PCR，检测mRNA表达。PCR扩增条件为：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s；循环40次。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1　PCR引物序列

1.3.2Western blotting检测SDF1-α蛋白表达用蛋白裂解液提取组织蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。Western blotting按常规方法进行，抗体为兔抗小鼠SDF1-α(1∶1000，英国Abcam公司)，采用ECL 化学发光法在瑞典Apharmacia Biotech公司生产的凝胶成像仪中曝光。

1.3.3免疫组织化学染色法检测SDF1-α蛋白的表达取肝癌和癌旁肝组织，制作石蜡切片，按常规方法进行免疫组化染色。一抗为兔抗小鼠SDF1-α(1∶200，英国Abcam公司)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶200，英国AbD Serotec公司)。阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。

1.3.4酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中SDF1-α蛋白的表达按ELISA试剂盒(美国R&D Systems公司)说明书进行操作。用酶标仪(3550UV型，美国Bio-Rad公司)450/540nm双波长检测各样品的吸光度(OD值)。根据标准品浓度得出标准曲线和换算公式，最后计算出待测样品的浓度。每块96孔板中取8孔作为板间对照和板内对照。

2结果

2.1索拉非尼治疗上调肝癌及癌旁组织中鼠源性SDF1-α的mRNA表达肿瘤微环境中的炎性因子在肿瘤的发生和发展中起重要作用[9]。我们收集了HCCLM3裸鼠原位瘤模型对照组、索拉非尼组的肝癌及癌旁肝组织的标本，通过RT-PCR检测了巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等分泌的炎性因子核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)、白细胞介素-6(interleukin-6， IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、环氧合酶1(cyclooxygenase 1, COX1)、COX2和SDF1-α的表达情况。结果发现，索拉非尼治疗明显上调了肝癌及癌旁肝组织中鼠源性SDF1-α的mRNA表达，而其他一些炎性因子却没有明显改变(图1A、B)，癌旁肝组织中鼠源性SDF1-α的mRNA表达远高于肝癌组织。同时，我们还检测了肝癌和癌旁肝组织中人源性SDF1-α的表达，发现肝癌和癌旁肝组织中人源性SDF1-α的mRNA表达量较低，且其表达水平在索拉非尼治疗前后没有明显变化(图1C)。以上结果说明，SDF1-α主要由基质细胞分泌，而非肿瘤细胞。

2.2索拉非尼上调肝癌和癌旁肝组织中鼠源性SDF1-α的蛋白表达水平我们用免疫组化法检测肝癌及癌旁肝组织中SDF1-α蛋白的表达情况。结果发现，在肿瘤组织中，SDF1-α主要来源于肿瘤细胞之间的间质细胞，索拉非尼能明显上调SDF1-α的表达(图2 A、B)；SDF1-α广泛分布于癌旁肝组织中，索拉非尼同样能上调癌旁肝组织中的SDF1-α表达(图2 C、D)。

因SDF1-α主要来源于癌旁肝组织，所以我们进一步用Western blotting法检测了两组癌旁肝组织中索拉非尼治疗前后SDF1-α的表达情况。结果显示，索拉非尼组癌旁肝组织中SDF1-α的表达明显高于对照组(图2E)。

2.3索拉非尼治疗使裸鼠外周血血浆中鼠源性SDF1-α浓度升高用ELISA法检测裸鼠外周血血浆中鼠源性SDF1-α的浓度发现，索拉非尼治疗可以明显升高外周血血浆中鼠源性SDF1-α的浓度(图2F)。

A：RT-PCR检测癌旁肝组织中鼠源性炎性因子的mRNA表达；B：RT-PCR检测肝癌组织中鼠源性炎性因子的mRNA表达；C：RT-PCR检测肝癌组织和癌旁肝组织中人源性SDF1-α的mRNA表达

图1

A～D： 免疫组化检测肝癌组织和癌旁肝组织中SDF1-α的表达情况，A、B为肝癌组织，C、D为癌旁肝组织；E： Western blotting检测癌旁肝组织中SDF1-α的表达情况；F： ELISA法检测荷瘤裸鼠外周血血浆中SDF1-α的浓度

图2

3讨论

血管生成在肿瘤的生长及转移过程中起关键作用。肝癌是多血管肿瘤，在肝癌的治疗中抗血管生成非常重要[10]。索拉非尼是现今临床上治疗晚期肝癌的一线用药[11]，它可以通过抑制血管生长因子受体(VEGFR)而起到抗血管生成的作用。目前，应用酪氨酸激酶抑制剂类药物(如sunitinib、brivanib等)和抗血管生成药物(如Bevacizumab)治疗肝癌的临床试验也正在进行[12]。然而，有关酪氨酸激酶抑制剂在肝癌治疗中的耐药情况以及不良反应，也已见诸于报告[13]。有研究[7]指出，应用索拉非尼治疗肝癌确实能够抑制原发瘤的生长并抑制肝癌的肺转移，但是，索拉非尼治疗后肿瘤的肝内播散灶增多，外周血肿瘤细胞数也增多。

肿瘤和癌旁微环境分泌的各种细胞因子对肿瘤的侵袭转移非常重要。炎性反应在癌症发生、发展中的作用也越来越受到关注。肝脏的炎性反应状态可能与HCC患者术后肿瘤的复发有关[14-15]。本研究用RT-PCR法检测了裸鼠肝癌组织和癌旁肝组织中一些与炎性反应相关的细胞因子在索拉非尼治疗前后的变化。结果显示，索拉非尼治疗能够上调肝癌组织以及癌旁肝组织中鼠源性SDF1-α的表达。我们同时检测了肿瘤组织和癌旁肝组织中人源性SDF1-α的表达，发现索拉非尼治疗前后人源性SDF1-α的表达差异无统计学意义。以上结果表明，SDF1-α并非肿瘤细胞分泌的。

SDF1又称为CXCL12，是一种趋化因子，主要由成纤维细胞、炎性细胞、内皮细胞等基质细胞分泌[8]。我们用免疫组化法分析肝癌组织和癌旁肝组织中SDF1-α的表达，证实了索拉非尼治疗可上调SDF1-α的表达，而且SDF1-α主要来源于肿瘤组织中的间质细胞并广泛分布于癌旁肝组织中。我们还通过Western blotting法和ELISA法再次证实了索拉非尼能上调癌旁肝组织中的SDF1-α的表达并可升高外周血血浆中SDF1-α的浓度。有动物实验研究[16]发现，对乳腺癌小鼠模型给予sunitinib治疗后，外周血SDF1-α的浓度明显升高，与本研究结果类似。

综上所述，索拉非尼治疗肝癌可明显上调肝癌微环境中SDF1-α的表达，这为我们寻找既能抑制索拉非尼的促肿瘤转移，又能协同增强索拉非尼的疗效的药物提供了新的思路。

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Effects of Sorafentib on the Expression of SDF1-α in Hepatocellular Carcinoma Tissues and Pericarcinoma Liver Tissues

LULuZHUWenweiCHENJinhongJIAHuliangDepartmentofGeneralSurgery，HuaShanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China

AbstractObjective：To explore the mechanism of the increased invasive and metastatic potential of hepatocellular carcinoma induced by sorafenib, by studying the expression of stromal-derived factor 1-α(SDF 1-α). Methods: BALB/c nude mice models of hepatocellular carcinoma in situ were established with cell line HCCLM3. The mice were divided into sorafenib group and control group, with 6 mice in each group. Sorafenib was administered intragastrically [30 mg/(kg·d)] in sorafenib group from 2 weeks after model had been established, while 0.9% sodium chloride solution was given in the control group. Mice were killed after treating for 4 weeks. The mRNA expressions of inflammation-related factors in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues of the two groups were detected by RT-PCR. The protein expression of SDF1-α in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues was measured by immunohistochemistry. The protein expression of SDF1-α in pericarcinoma liver tissues was also detected by Western blotting. ELISA was performed to detect the SDF1-α concentration in peripheral blood. Results: The mRNA expression of murine SDF1-α in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues was significantly increased by sorafenib therapy. The results of immunohistochemistry and Western blotting showed that protein expression level of SDF1-α in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues was significantly up-regulated by sorafenib. The results of ELISA assay showed that the concentration of murine SDF1-α in peripheral blood was increased by sorafenib. Conclusions: The expression of SDF1-α in hepatocellular carcinoma tissues and pericarcinoma liver tissues can be up-regulated by sorafenib therapy.

Key WordsHepatocellular carcinoma；Sorafenib；Stromal-derived factor 1-α；Invasion and metastasis

通讯作者贾户亮，E-mail：jbl-1@163.com

中图分类号R735.7

文献标识码A