非肥胖性糖尿病小鼠在1型糖尿病发病过程中的基因表达谱改变

李敏　宋陆军　高晓东　常文举　付亮　秦新裕

(复旦大学附属中山医院普外科，上海　200032)



·论著·

非肥胖性糖尿病小鼠在1型糖尿病发病过程中的基因表达谱改变

李敏宋陆军高晓东常文举付亮秦新裕

(复旦大学附属中山医院普外科，上海200032)

摘要目的：用基因表达谱芯片检测非肥胖性糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠在1型糖尿病(T1DM)发病过程中的基因表达。方法： 分离T1DM未发病及发病NOD小鼠的胰岛细胞，提取其总RNA后，与瑞士Roche NimbleGen公司的 12×135K基因表达谱芯片杂交。采用NimbleScan软件分析表达数据。结果：未发病NOD小鼠组和发病NOD小鼠组共有1007个差异表达基因。基因本体(gene ontology，GO)分析显示，在生物学过程方面，上调基因中87.7%与代谢相关，下调基因中18.97%与代谢相关；在细胞组分方面，29.20%的上调基因与细胞及细胞成分相关，78.08%的下调基因与细胞骨架、微管细胞骨架相关；在分子功能方面，84.07%的上调基因与结合有关，30.77%下调基因与水解酶活性相关。Pathway分析显示，上调的信号通路主要为黏蛋白型O聚糖合成信号通路，下调的信号通路主要为血管加压素信号通路。结论：T1DM发病NOD小鼠和未发病NOD小鼠的胰岛细胞的基因表达水平有明显差异。

关键词小鼠；1型糖尿病；基因表达谱芯片

基本项目：教育部博士点基金资助项目(编号：20090071110019)；上海市自然科学基金资助项目(编号：09ZR1405900)；复旦大学附属中山医院青年科学基金(编号：2013ZSQN23)

截至2013年，全球糖尿病患者已达 3.82亿例，预计到2035年将达5.92亿例[1]。糖尿病有两种类型，其中1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是由于机体自身抗原耐受机制破坏而导致的一种器官特异性的免疫性疾病，它是由自身反应性CD4+及CD8+T淋巴细胞浸润胰岛而导致胰岛β细胞的损伤而引起的。目前认为，免疫、基因和环境等因素共同参与了T1DM的发生与发展[2]。

非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠可以自发T1DM，且同人类T1DM的发病特点相似，故NOD小鼠是国际公认的T1DM模型。本研究通过基因表达谱芯片检测T1DM发病与T1DM未发病NOD小鼠胰岛细胞的基因表达差异，发现在T1DM的发病过程中有多条信号通路被激活，现报告如下。

1资料与方法

1.1实验动物与主要试剂4～30周雌性NOD小鼠购自中国科学院上海实验动物中心，体质量25～34 g，无特定病原体(specefic pathogen free,SPF)级。胶原酶V、4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)、烟酰胺、双硫腙(dithizone，DTZ)购自美国Sigma-Aldrich 公司； RPMI 1640、胎牛血清购自美国Gibco公司；Ficoll 400购自美国Pharmacia 公司；Hanks、D-Hanks液购自生工生物工程(上海)股份有限公司；毛细吸管购自美国BD 公司；基因表达谱芯片购自瑞士Roche NimbleGen公司。

1.2小鼠胰岛的分离和纯化麻醉小鼠后，开腹，在胆总管靠近十二指肠的一侧剪开一个小口。将输液器头插入1 mL胰岛素注射器内，抽取2.5 mL胶原酶(1 mg/mL)；在针头部插入超细软管，将导管插入胆总管内，远端靠近肝门部结扎。注入2 mL 胶原酶，可见胰腺组织迅速膨胀，呈透明状。切取胰腺组织后放入D-Hanks 液，37℃水浴静止消化15 min。消化后轻微震荡，至胰腺组织呈细沙状，加入4℃的含有10%胎牛血清的D-Hanks 40 mL终止消化，以1000 r/min离心2 min后弃上清液；重复3 遍。配置分离液，步骤如下：首先配置50%的Ficoll液，称取10 g Ficoll，溶解于20 mL D-Hanks液中，在37℃溶解4 h；配置25%的Ficoll液，取9.2 mL 25%的Ficoll液，加入0.8 mL D-Hanks 液，或为23%的Ficoll液；取8 mL 25%的Ficoll液，加入 D-hanks 至10 mL，为20%的Ficoll液；取4.4 mL 25%的Ficoll液，加D-Hanks 至10 mL，为11%的Ficoll液。在含有胰岛细胞的沉淀液中加入5 mL 25%的Ficoll液，混匀，然后依次加入4 mL 23%的Ficoll液、3 mL20%的Ficoll液、3 mL 11%的Ficoll液，1800 r/min离心5 min。在20%~23%界面和11%~20%界面收集胰岛细胞。加入0℃的 D-Hanks 液洗涤后，1000 r/min离心3 min；重复2 次，收集胰岛细胞，用培养基洗涤后，用无菌的毛细移液管在相差显微镜下挑选单个胰岛，将胰岛用DTZ染色，以保证培养胰岛的纯度[3]。

1.3T1DM未发病及发病NOD小鼠胰腺组织基因组分析分别提取T1DM未发病及发病NOD小鼠胰岛细胞的总RNA，用美国 Nanodrop 公司ND-1000分光光度计检测及变性琼脂糖凝胶电泳对样品进行质量检测。每组取5 μg RNA用于标记及芯片杂交。将扫描得到的图像导入NimbleScan 软件(VER 2.5)，进行表达数据等相关分析。该部分实验由上海康成生物有限公司完成。

2结果

2.1T1DM未发病NOD小鼠与发病NOD小鼠胰腺胰岛细胞样本总RNA电泳图未发病NOD小鼠与发病NOD小鼠胰腺胰岛样本总RNA的电泳图(图1)。从电泳图上可以看到3条清晰的 5S、18S、28S rRNA条带，条带依次加深，且28s rRNA的亮度约为18s rRNA的2倍。分光光度仪检测显示， OD260/OD280比值均为 1.9～2.0，提示总 RNA 质量较好，可以进行后续实验。

图1　未发病NOD小鼠与发病NOD小鼠胰腺胰岛样本

2.2NOD小鼠胰岛的基因芯片杂交结果用未发病NOD小鼠与发病NOD小鼠的胰岛细胞样本提取总RNA，反转录ds-cDNA并用Cy3荧光素标记后，分别与NimbleGen 12×135K基因表达谱芯片在42℃杂交16～20 h，用美国AXON公司GenePix4000B芯片扫描仪扫描得到芯片杂交图象。采用专业软件分析杂交图像文件，提取基因表达的荧光信号强度值，将扫描得到的图像导入NimbleScan软件(VER 2.5)，进行表达数据等相关分析，剔除表达程度过低的基因，从而得到未发病NOD小鼠和发病NOD小鼠胰岛的芯片杂交图。表达谱芯片上可见密集的Cy3 绿色荧光。见图2。

2.3分层聚类分析采用分层聚类分析对样品的表达水平进行重新分组，探索样本之间的关系，结果如图3所示，两组表达谱明显不同。

A：未发病鼠；B：发病鼠

树枝的长度表示两组数据的相似程度，红色显示两组基因表达紧密相关，蓝色部分显示两组间关系不密切

图3分层聚类分析树状图

2.4GO分析为了详细研究差异表达基因的功能分类，对差异表达基因进行GO分析。GO分析从生物学过程、分子功能和亚细胞组分三个方面对基因的功能进行分类，每大类又可分为下一级及更下一级的分支。根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同GO分类中某(几)个特定分支的超几何分布关系。GO分析会对每个有差异基因存在的GO得出一个P值，P值越小(P≤0.05)表示差异基因在该GO中的富集越明显。

对GO分析结果作饼图，结果显示，差异表达的基因涉及生物学过程、亚细胞组分和分子功能。生物学代谢过程方面，有885个(87.7%)与代谢相关的基因上调，主要包括115个(11.40%)与代谢过程相关的基因、109个(10.80%)与主要代谢过程有关的基因、105个(10.40%)与细胞代谢相关的基因、88个(8.72%)与巨分子代谢过程相关的基因、81个(8.03%)与细胞巨分子代谢过程相关的基因、72个(7.14%)与含氮复合物的代谢过程相关的基因、69个(6.84%)与细胞的含氮复合物的代谢过程相关的基因、67个与(6.64%)核酸代谢过程相关的基因及179个(17.74%)与细胞其他代谢过程有关的基因；下调的基因主要包括22个(18.97%)与代谢有关的基因和21个(18.10%)与催化活性相关的基因。在细胞组分方面，表达上调的基因分布比较均匀，表达上调最高的为细胞及细胞成分相关基因488个(29.20%)，其他分别为胞内组分相关基因358个(21.42%)、膜结合细胞器及胞内膜结合细胞器相关基因272个(16.28%)、细胞膜组分相关基因117个(7.00%)；下调基因主要为细胞骨架、微管细胞骨架及相关组分基因57个(78.08%)。分子功能方面，表达上调的基因中591个(84.07%)与结合相关，主要为蛋白结合相关基因91个(12.95%)、金属离子结合相关基因57个(8.11%)、阳离子结合相关基因57个(8.11%)及核酸结合相关基因53个(7.54%)；下调的分子功能相关基因主要包括44个(30.77%)水解酶活性相关基因、17个(11.89%)酶调节活性相关基因。

2.5Pathway 分析Pathway 分析是一种将基因绘制在KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路中的一种功能分析，可以筛选出两个实验组之间具有显著差异的信号转导通路。其中P值代表Pathway的重要性，P值越低，则表明此Pathway的作用越重要。

本研究中，基因表达上调的信号通路主要包括与小鼠肌肉相关的信号通路，如黏蛋白型O-聚糖合成信号通路、黏多糖合成角质硫酸信号通路、Fanconi贫血信号通路及胰液分泌信号通路等；基因表达下调的信号通路主要有血管加压素信号通路、卵母细胞减数分裂信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟信号通路、mTOR信号通路、糖基化磷脂酰肌醇锚合成信号通路、青春晚期糖尿病信号通路及嘌呤代谢信号通路等。

3讨论

基因芯片技术基于核酸分子探针及互补核酸序列之间的特异性结合，将数百万的信息通过微印刷或原位寡核苷酸合成技术集成到玻璃或硅质载体上，通过荧光、化学发光、电化学或放射化学检测芯片的杂交结果，判断待测目标的相对核酸序列含量。基因芯片具有快速、高通量及样本用量少的特点，能够快速地对疾病的相关基因进行筛选，并对疾病的分类、预后、治疗提供有用的信息，适用于海量基因序列信息的筛选及分析。它的出现大大加快了基因表达分析、比较基因组杂交、单核苷酸多态性(SNP)检测以及蛋白质-DNA相互作用的研究。

本研究采用最新的基因组表达谱芯片(12×135K)， 该芯片包含约44170个基因，每个基因分别用3个探针检测，基本上涵盖了目前已知的全部小鼠基因，是分析基因表达谱的有力工具。我们用该芯片分别检测T1DM未发病及发病NOD小鼠的表达谱，共得到1007个差异表达基因(其中表达上调的基因432个，下调的基因575个)，为筛选相关致病基因提供了依据。

我们对GO分析结果作饼图，以生物学过程，分子功能和亚细胞组分三个大类进行分析，并标示出每一分类中富集明显的前十个条目。结果显示，在生物学过程中，表达上调的代谢相关的差异基因占87.7%，主要包括代谢过程、主要代谢过程、细胞代谢、巨分子代谢过程、细胞巨分子代谢过程、含氮复合物的代谢过程、细胞的含氮复合物的代谢过程及核酸代谢过程；下调的代谢相关的差异基因占 18.97%，主要包括与催化活性相关的基因。这些结果提示，胰岛细胞的代谢、增殖和凋亡等生理过程出现异常，导致胰岛细胞的坏死或凋亡[4]。在细胞组分方面，表达上调的基因分布比较均匀，表达上调最高的基因与细胞及细胞成分相关，其余依次为胞内组分、膜结合细胞器及胞内膜结合细胞器；表达下调的基因主要与细胞骨架、微管细胞骨架及相关组分相关。这表明，胰岛细胞维持细胞及相关细胞器结构的功能下降。在分子功能方面，表达上调的基因与结合有关的占84.07%，主要为蛋白结合、金属离子结合、阳离子结合及核酸结合；表达下调的基因主要与水解酶活性及酶调节活性有关。这表明，参与胰岛新陈代谢以及生物调控的基因表达下调。

从Pathway 分析结果来看，基因表达上调的信号通路主要为小鼠肌肉相关的信号通路，包括黏蛋白型O-聚糖合成信号通路、黏多糖合成角质硫酸信号路及Fanconi贫血信号通路等；基因表达下调的信号通路主要有血管加压素信号通路、卵母细胞减数分裂信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟信号通路等。

综上所述，我们发现，T1DM未发病的NOD小鼠与已发病的NOD小鼠胰岛基因表达谱明显不同，在代谢过程和分子功能方面有较大差异。这些关于T1DM发病NOD小鼠与未发病NOD小鼠差异表达基因的信息为筛选相关致病基因提供了依据，以后可从中挑选感兴趣的基因或相应的蛋白进行深入研究，以探寻T1DM诊断和治疗的新方向。

参考文献

[1]Guariguata L, Whiting DR, Hambleton I, et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035[J]. Diabetes Research and Clinical Practice, 2014,103(2):137-149.

[2]Li M, Song LJ, Qin XY. Advances in the cellular immunological pathogenesis of type 1 diabetes[J]. J Cell Mol Med, 2014,18(5):749-758.

[3]李敏, 宋陆军, 高晓东, 等. 一种高效的小鼠胰岛分离纯化新技术[J]. 中国临床医学, 2011(2):145-146.

[4]Brooks-Worrell B, Palmer JP. Immunology in the Clinic Review Series; focus on metabolic diseases: development of islet autoimmune disease in type 2 diabetes patients: potential sequelae of chronic inflammation[J]. Clin Exp Immunol, 2012,167(1):40-46.

基本项目：山东省自然科学基金(编号：ZR2010HM041)；山东省临沂市科学技术发展计划(编号：201413006)

Changes of Gene Expression Profile in Non-Obese Diabetic Mice during the Development of Type 1 Diabetes Mellitus

LIMinSONGLujunGAOXiaodongCHANGWenjuFULiangQINXinyuDepartmentofGeneralSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To explore the genetic changes in non-obese diabetic(NOD) mice during the development of Type 1 diabetes mellitus (T1DM) with gene expression microarrays. Methods: The pancreatic islet cells of NOD mice without or with T1DM were isolated. Total RNA was extracted separately, and hybridized with 12×135K gene expression microarrays (Roche NimbleGen Inc.). NimbleScan software was used for data analysis of gene expression. Results: A total of 1007 differentially expressed genes were obtained from non-diabetic and diabetic NOD mice. The gene ontology(GO) analysis showed that, on aspect of biological processes, 87.7% of the up-regulated genes were associated with metabolism, while 18.97% of the down-regulated genes were associated with metabolism. On aspect of cellular components, 29.20% of the up-regulated genes were associated with cells and cell components, while 78.08% of the down-regulated genes were associated with cytoskeleton and microtubule cytoskeleton. On aspect of molecular function, 84.07% of the up-regulated genes were associated with binding, while 30.77% of the down-regulated genes were hydrolase activity related genes. The pathway analysis showed that the main signaling pathway for up-regulating was mucin type O-Glycan biosynthesis pathway, and the main signaling pathway for down- regulating was vasopressin pathway. Conclusions: There are significant differences in gene expression profile of pancreatic islet cells between NOD mice with T1DM and NOD mice without T1MD.

Key WordsMouse；Type 1 diabetes mellitus；Gene expression microarrays

通讯作者秦新裕，E-mail: 13918126134@163.com 赵孔波，E-mail：zhaokongbo@163.com

中图分类号R587.1

文献标识码A