氟对大鼠心肌细胞凋亡及p53蛋白表达的影响*

吴起清沈岳良刘开泰钟近洁△(.永州职业技术学院,湖南永州 4500; .新疆医科大学基础医学院,新疆乌鲁木齐 80054; .中国疾病预防控制中心农村改水技术指导中心,北京 000)

氟对大鼠心肌细胞凋亡及p53蛋白表达的影响*

吴起清1沈岳良2刘开泰3钟近洁2△
(1.永州职业技术学院,湖南永州 425100; 2.新疆医科大学基础医学院,新疆乌鲁木齐 830054; 3.中国疾病预防控制中心农村改水技术指导中心,北京 102200)

摘要目的:研究氟化钠对Wistar大鼠心肌细胞凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法:40只3~4周龄健康雄性Wistar大鼠,随机分为氟化钠25、50、100、150 mg·L-14个实验组和一个对照组,实验组每日饮用含不同氟化钠浓度的蒸馏水,对照组饮用正常蒸馏水,复制慢性氟中毒大鼠动物模型。实验开始和6个月时各描记心电图一次,实验期结束后处死各组大鼠切取心肌组织;采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导d UTP的缺口末端标记法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)测定心肌细胞凋亡情况。运用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)定量检测p53蛋白表达。结果:(1)心电图显示:氟化钠100 mg·L-1和150 mg·L-1组氟中毒大鼠Q-T间期与对照组相比明显缩短(P<0.05)。(2)氟化钠100 mg·L-1组和150 mg·L-1组心肌细胞凋亡指数明显高于对照组(P<0.01),且相关基因p53的表达也明显高于对照组(P<0.01)。结论:氟可导致心肌细胞凋亡,p53参与并介导细胞凋亡。

关键词:氟;心肌;细胞凋亡;p53基因

大量研究结果表明,过量氟可导致机体多种细胞发生凋亡[1-2]。P53蛋白是抑癌基因p53的表达产物,对细胞凋亡和肿瘤细胞的增殖、分化具有重要的调节作用,是关键性调控分子之一[3]。有关氟对心脏的损伤,氟中毒病区现场检查显示氟与心脏病发病相关,氟中毒病区人群观察到心脏损害表现[4];在实验研究方面,无论是动物实验还是体外实验均证实氟可引起心脏损伤[5],但其毒性作用机制目前尚不十分清楚。因此本文拟选用Wistar大鼠经饮水投氟复制氟中毒动物模型,通过检测氟中毒大鼠心肌细胞凋亡率及其相关基因p53来探讨氟中毒对心肌损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

氟化钠(分析纯,北京化工厂生产);6511型心电图机(日本光电公司产品);原位细胞凋亡检测试剂盒(武汉华美生物工程公司)。PE-P53及相应同型对照均由Phar Mingen公司提供;破膜剂IntraPrep由美国贝克曼库尔特公司提供。FACScan型流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品。普通光学显微镜(日本Olympus公司,BX-50型)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与实验处理

选取40只3~4周龄健康雄性Wistar大鼠(由新疆医科大学动物实验中心提供,按自然昼夜节律采光,室温20~25℃,普通饲料喂养),随机分为氟化钠25、50、100、150 mg·L-14个实验组和一个对照组,实验组每日饮用含不同氟化钠浓度的蒸馏水,对照组饮用正常蒸馏水(n=8,分笼饲养),复制慢性氟中毒大鼠动物模型。大鼠实验期为6个月。实验开始和6个月时各描记心电图一次,实验期结束后处死各组大鼠,切取心肌组织,一部分心肌称重后浸于4%多聚甲醛溶液固定18 h左右,石蜡包埋;另一部分置入液氮快速冷冻后转入-80℃冰箱冻存,备后期实验用。

1.2.2 心电图记录

经大鼠腹腔注射20%的乌拉坦0.5 m L·kg-1麻醉后,仰卧位固定于恒温控制操作台上,应用心电图机描记I,II,III标准导联。标准电压为1 m V= 20 mm,走纸速度为50 mm· s-1。导联连接采用5 cm长针炙针刺入四肢,鳄鱼夹连接导线。观察指标为心率、T波电压、Q-T间期。实验在室温为20 ~25℃的条件下进行。实验开始时心电图首次描记:Q-T间期、T波电压以及心率各组比较均无差异(P>0.05)。

1.2.3 凋亡细胞原位标记(TUNEL)及凋亡细胞半定量分析

取心肌组织切片采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导d UTP的缺口末端标记法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL),常规脱蜡入水,经30 m L·L-1H2O2处理、蛋白酶K消化后,加入TDT和Dig·d UTP 4℃过夜,封闭后加生物素化抗地高辛抗体,洗涤,加SABC,DAB显色。光镜下观察阳性标记的细胞数,阳性标记的凋亡细胞核呈棕褐色,阴性者细胞核呈蓝色。在计算机图像分析仪上,于阳性表达分布区域在光镜400倍视野下,每张切片随机拍摄5个无重叠阳性视野,每个视野计数200个细胞核,计数阳性细胞(凋亡细胞)和总细胞,凋亡指数(Apoptosis index,AI)=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 流式细胞术及p53基因蛋白表达的定量分析

将新鲜心肌组织用机械剪碎法制成单细胞悬液,用400目筛网过滤,再低速离心去除细胞碎片,70%冰冷乙醇固定,放4℃冰箱备检。检测前先用PBS洗涤细胞,再用PBS调整细胞浓度为1×l06·ml-1;细胞用破膜剂打孔后,加PE-p53抗体标记,并设同型阴性对照;经离心洗涤后加500μl PBS液悬浮细胞,上机检测,每次检测10000个细胞。以对数方式采集数据,以荧光指数(Fluorescence index,FI)表示它们的相对含量,计算公式为:荧光指数FI=(实验样品蛋白表达的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/(对照样品蛋白表达的平均荧光强度)。

1.2.5 统计方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析,所有数据以X±SD表示,多个样本均数间的比较采用完全随机设计的单因素方差分析(One-way ANOVA);如果差异有统计学意义,再进行组内两两比较,采用SNK-q检验(Student-Newman-Keuls法), P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 氟化钠对大鼠心电图的影响

如表1所示,不同浓度氟化钠引起Q-T间期发生变化。T波电压各组相比无差异(P>0.05)。氟化钠25 mg·L-1组和50 mg·L-1组氟中毒大鼠Q-T间期与对照组相比无差异(q25-0=0.6346,P>0.05;q50-0=0.6129,P>0.05),氟化钠100 mg·L-1组和150 mg·L-1组氟中毒大鼠Q-T间期与对照组相比明显缩短(q100-0=4.7449,P<0.05;q150-0=5.2136, P<0.01),氟化钠25 mg·L-1组与150 mg·L-1组相比则有显著差异(q100-25= 4.1103,P < 0.01;q100-50= 4.1319, P<0.05;q150-25=4.579,P<0.01,q150-50=4.6007,P<0.05),氟化钠25 mg·L-1组与50 mg·L-1组相比无差异(q25-50= 0.0216,P>0.05),氟化钠100 mg·L-1组与150 mg·L-1组比较无差异(q100-150=0.4687,P>0.05)。心率各组比较均无差异(P>0.05)。

表1　氟对Wistar大鼠心电图的影响(±SD,n=8)

表1　氟对Wistar大鼠心电图的影响(±SD,n=8)

注:与对照组相比,*P<0.05。

组别(NaF,mg·L-1)心率(次·分-1) T波电压(MV×10-2) Q-T间期(MS) 0(对照组)　 321.01±57.16　 29.71±10.99 97.13±4.36 25　327.78±64.28　 30.02±5.69 96.25±4.93 50　329.76±45.96　 29.38±8.63 96.28±4.70 100　355.22±76.71　 24.15±9.60 90.55±2.72*150　315.27±63.99　 24.17±7.64 89.90±2.03*

2.2 心肌细胞AI及各组比较

TUNEL标记的凋亡阳性细胞胞核呈棕褐色。如表2所示,对照组、氟化钠25 mg·L-1组未见凋亡细胞,氟化钠50 mg·L-1组、100 mg·L-1组和150 mg·L-1组细胞凋亡指数(AI)分别为3.21%±0.40%,16.56%±1.12%, 56.43%±1.96%,显著高于对照组(P<0.01)。

表2　五组大鼠心肌细胞凋亡指数和p53表达比较(±SD,n=8)

表2　五组大鼠心肌细胞凋亡指数和p53表达比较(±SD,n=8)

注:(1)与对照组、氟化钠25 mg·L-1组比较,★P<0.01;与氟化钠50 mg· L-1组比较,▲P<0.01;与氟化钠100 mg·L-1组比较,■P<0.05;(2)与对照组比较,*P<0.01;与氟化钠100 mg·L-1组比较,△P<0.01。

组别(NaF,mg·L-1)　　凋亡指数(AI)(%) 　p53表达0(对照组)　0　3.35±0.21 25　0　3.46±0.29 50　3.21±0.40★　3.51±0.32 100　16.56±1.12★▲　5.91±0.42*150　56.43±1.96★▲■　6.40±0.47△

2.3 p53蛋白表达的比较

如表2所示,氟化钠100 mg·L-1组和150 mg·L-1组p53蛋白表达显著高于对照组(P < 0.01)。氟化钠150 mg·L-1组p53蛋白表达显著高于100 mg·L-1组(P< 0.01)。氟化钠25 mg·L-1组和50 mg·L-1组p53蛋白表达与对照组比较无明显变化(P>0.05)。

3 讨论

氟对心脏的影响主要表现在心电图、心肌收缩力及心肌形态等方面的改变,其中心电图是反映心脏功能性和器质性改变较敏感的指标。本实验中心电图结果显示:氟化钠100 mg· L-1和150 mg·L-1组大鼠Q-T间期与对照组比较明显缩短,这与杨晓霞等[6]实验结论相一致。细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核糖核苷酸转移酶的催化下加上DIG标记的d UTP,从而可以通过荧光显微镜进行检测凋亡的细胞。本实验中末端标记法检测结果显示:对照组、氟化钠25 mg·L-1组未见凋亡的心肌细胞,氟化钠50 mg·L-1组少见凋亡细胞,而100 mg·L-1组和150 mg·L-1组凋亡细胞明显增多,上述结果说明细胞凋亡参与氟化钠导致心肌损伤过程。

1979年LINZER等在DNA病毒SV40转染的哺乳动物细胞中发现了一种与SV40大T抗原结合的蛋白,因其分子量为53 kd而命名为P53。正常机体表达的是野生型P53(wtP53),对细胞生长具有负面调节作用;当机体组织细胞受到外来刺激时,可发生基因突变而变成突变型P53(mtP53),其功能与wtP53相反。P53可调节多种基因(如p21,c-myc,bcl-2,IL-2, fas和bax等)的表达,对细胞的增殖分化具有重要影响[7];同时P53是细胞应激的关键性调控分子之一,通过转录或非转录途径对细胞危急事件信号做出包括细胞生长抑制或凋亡在内的不同反应,因而一直是生物医学研究领域的热点之一。氟化钠所致的心肌细胞凋亡与其他类型细胞凋亡一样,可能受到许多细胞凋亡相关基因的调控,这其中包括p53。本次实验对P53蛋白表达的测定结果显示氟化钠100 mg·L-1组和150 mg·L-1组P53蛋白表达显著高于对照组,氟化钠25 mg·L-1组和50 mg·L-1组p53蛋白表达与对照组比较无明显变化,与褚启龙等[8]实验研究所表明的p53具有引起细胞凋亡作用相一致。凋亡率高者p53表达也相应增高,提示p53基因上调,依赖p53基因的凋亡通路在氟中毒对心肌损伤的机制中起到重要作用。当然,氟具体通过何种机制调节p53蛋白表达有待进一步研究加以证实。

参考文献

1 Refsnes M,Schwarze PE,Holme JA,et al.Fluorideinduced apoptosis in human epithelial lung cells(A549 cells):role of different G protein-linked signal systems[J].Hum Exp Toxicol,2003,22(3): 111-123.

2 Tokunaga T,Morshed SR,Otsuki S,et al.Effect of endodontic agents on cytotoxicity induction by sodium fluoride[J].In Vivo, 2003,17(6):583-591.

3 Hall PA,Meek D,Lane DP.P53-integrating the complexity[J].J Pathol,1996,180(1):1-5.

4 冀芳,徐红,张跃新,等.氟骨症患者心血管系统损害的研究[J].中国地方病防治杂志,2004,19(6):321-323.

5 张德新.氟化物致体外培养大鼠心肌细胞的形态损伤[J].公共卫生与预防医学,2005,16(3):52-52.

6 杨晓霞,富冀枫,宋术亮,等.氟硒对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响[J].中国地方病学杂志,1995,14(5):257-260.

7 姜泊.细胞凋亡基础与临床[M].北京:人民军医出版社,1999,27 -28.

8 褚启龙,哈建利,夏涛,等.氟对人胚肝细胞DNA损伤及p53蛋白表达影响[J].中国公共卫生,2011,27(9):1154-1155.

Effects of exposure of rats to fluoride on myocardial apoptosis and the expression of p53*

Wu Qi-qing1,Shen Yue-liang2,Liu Kai-tai3,Zhong Jin-jie2△
(1.Yongzhou Vocational Technical College,Hunan Yongzhou 425100; 2.Preclinical College,Xinjiang Medical University,Xinjiang Urumqi 830054; 3.National Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102200)

Abstract Objective:To study the effects of exposure of rats to fluoride on myocardial apoptosis and its mechanism.Methods: Forty 3~4-week-old male Wistar rats were randomly divided into 4 experimental groups:25,50,100,150 mg·L-1sodium fluoride (NaF)group and control group.All the experimental groups were fed with distilled water containing different concentrations of NaF respectively,and the control group with normal distilled water in order to duplicate the animal model of drinking water type fluorosis. Electrocardiogram(ECG)was taken before and after experiment for 6 months to observe ECG of the rats with fluorosis.Apoptotic cardiomyocytes were detected with TUNEL and the protein expression of p53 in cardiomyocytes was determined by the techniques of flow cytometry.Results:(1)As compared with control group,the Q-T interval in 100 mg·L-1group and 150 mg·L-1group were markedly shorter(P<0.05).(2)As compared with control group,the apoptosis rate of cardiomyocytes in 100 mg·L-1group and 150 mg·L-1group were significantly increased(P<0.01),accompanied with an increased expression of p53(P<0.01).Conclusion: Fluorosis can induce myocardial apoptosis,p53 may be involved in the regulation of the apoptotic process.

Key Words:Fluoride;Cardiomyocyte;Apoptosis;p53 gene

(收稿日期：2015-8-10)

通讯作者:△钟近洁,女,教授,主要从事环境与健康研究,Email: zhongjinjie@gmail.com。

作者简介:吴起清,男,讲师,主要从事心血管生理学研究,Email: 754777550@qq.com。

*基金项目:国家自然科学基金资助(编号:30860249)