氧化白藜芦醇体内外抑制小鼠肉瘤S180的作用初步研究

陈夏静熊尧任为许可 周黎明△(.成都市妇女儿童医院药剂科,四川成都 6009; .四川大学基础医学与法医学院,四川成都6004)

氧化白藜芦醇体内外抑制小鼠肉瘤S180的作用初步研究

陈夏静1熊尧2任为2许可 周黎明2△
(1.成都市妇女儿童医院药剂科,四川成都 610091; 2.四川大学基础医学与法医学院,四川成都610041)

摘要目的:研究氧化白藜芦醇在体外对肿瘤细胞株以及小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测氧化白藜芦醇对人的各种肿瘤细胞株体外增殖的抑制作用,并计算其半数抑制浓度(IC50)。建立小鼠S180肉瘤移植瘤模型,分为对照组、环磷酰胺组、氧化白藜芦醇80、40、20 mg·kg-1剂量组,以实体瘤瘤块重量及抑瘤率为指标评价氧化白藜芦醇对小鼠移植瘤生长的抑制作用,并计算其胸腺指数和脾脏指数。结果:MTT结果显示,氧化白藜芦醇对K562,SK-OV-3,MCF -7,SMMC-7721,A549,HNE-1和SW-480细胞株IC50值分别为52.88±3.21,11.55±5.42,23.61±2.13,58.13±4.84,7.44 ±2.94,67.73±7.23和62.86±5.2μg·ml-1,有较好的抑制肿瘤细胞体外生长作用。体内试验显示氧化白藜芦醇对移植瘤的抑制作用明显,80、40、20 mg·kg-1三个剂量组对S180移植瘤抑制率为77.78%,61.43%和38.56%,呈一定量效关系,并对胸腺指数和脾脏指数影响不大。

关键词:氧化白藜芦醇;人肿瘤细胞株;S180

Key Words:Parthenolide;PC-3;Apoptosis;Bax mRNA;Bcl-2 m RNA Oxyresveratrol;Cancer cell line;S180

氧化白藜芦醇(Oxyresveratrol)是一种天然活性物质,存在于多种植物中,可从桑科Moraceae,桃金娘科Myrtaceae,百合科Liliaceae,买麻藤科Gnetaceae等植物中提取。文献报道其有抗病毒,抗氧化等作用,体外实验证实氧化白藜芦醇为酪氨酸酶抑制剂,可抑制嗜碱性细胞组胺释放;对于平滑肌的收缩亦有抑制作用。白藜芦醇具有抑制肿瘤细胞作用已有大量的报道,从化学结构上讲,氧化白藜芦醇与白藜芦醇有相同的主要结构,为此,我们用细胞株在体外测试其抑制肿瘤细胞株的作用,在体内用小鼠S180模型研究其抑制肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与动物

人白血病细胞株K562,人卵巢癌细胞SK-OV-3,人乳腺癌细胞MCF-7,人肝癌细胞SMMC-7721,人肺癌细胞A549,人鼻咽癌细胞HNE-1,人结肠癌细胞SW480,购自上海细胞库,由四川大学基础医学与法医学院药理教研室冻存。鼠源性S180肉瘤细胞,均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心并由本实验室保存。昆明种小鼠,雄性,体重18~22 g,共150只,动物合格证SCXK(川)2008-24,购自成都达硕生物科技有限公司。

1.1.2 药物与试剂

试验化合物:氧化白藜芦醇,纯度≥98%,(HPLC)由四川大学华西药学院王峰鹏教授提供;注射用盐酸多柔比星(阿霉素),浙江海正药业股份有限公司,批号090204A。RPMI-1640培养基,成都哈里生物公司;小牛血清,批号090625,成都哈里生物公司;四甲基偶氮唑盐(MTT),Sigma公司;二甲基亚砜(DMSO),天津市瑞金特化学品有限公司;台盼蓝,Sigma公司;胰蛋白酶,成都哈里生物公司。环磷酰胺粉针剂,购自江苏恒瑞医药股份有限公司,批号11030621

1.1.3 仪器设备

CO2培养箱,日本SANYO公司;超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;全自动酶标仪,型号DNM9602G,北京普朗新技术有限公司;细胞培养瓶,NEST96孔培养板。

1.2 方法

1.2.1 MTT实验检测IC50值

收集对数生长期细胞,加入96孔板,每孔加入100μl细胞悬液,每孔细胞数为优化后数量(约5×103个·孔),边缘孔用无菌PBS溶液填充,待细胞贴壁后,设置试验药物组,加入终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5125μg·ml-1氧化白藜芦醇;阳性对照组,加入终浓度为32、16、8、4、2、1、0.5μg· ml-1的多柔比星;用药组每个浓度设3个复孔,再设置不含细胞的完全培养基为空白组;以及未经药物处理的正常培养细胞作为阴性对照组,终体积均为200μl。孵育48 h后,吸弃含药物的RPMI-1640培养基,每孔加入100μl无酚红RPMI-1640培养基、20μl浓度为5 mg·ml-1的MTT溶液,终止培养,小心吸弃孔内培养液及MTT溶液;每孔加入100μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡至紫色结晶物充分溶解,在全自动酶标仪上测定OD570 nm处的吸光值,同时以等体积的空白DMSO设定调零孔。细胞生长抑制率=(1-OD样品/OD阴性)×100%。

1.2.2 体内抑制小鼠S180肉瘤的生长

移植性S180肝癌细胞的小鼠腹水接种腋下制备小鼠荷瘤模型,待试验小鼠接种1天后,按随机数字表示将小鼠分为5 组,每组10只:腹腔注射给予环磷酰胺溶液60mg·kg-1小鼠体重,每周给药1次,共计给药2次;氧化白藜芦醇80、40、20 mg·kg-1三组,给药方式均为腹腔注射。阴性对照组为注射等体积的生理盐水;阴性对照组及氧化白藜芦醇组皆按照每天注射1次,每周注射6次,共计注射12次给药,连续饲养14 d。每天观察,测量并记录小鼠体重、瘤径及死亡情况,计算小鼠死亡率,死亡率=(各组死亡动物数量/各组动物总数)× 100%。于末次给药24 h后,脱颈椎处死小鼠,剥离肿瘤,取脾脏及胸腺分别称重,计算肿瘤抑制率,肿瘤抑制率(%)=[1-(平均实验组瘤重/平均阴性对照组瘤重)]×100%,免疫脏器系数,脾脏(胸腺)系数=[脾脏(胸腺)重量(mg)/体重(g)]× 100%。实验重复3次。

1.3 统计方法

数据采用统计学软件SPSS16.0进行统计分析,实验结果以±SD表示。实验采用单因素方差分析及t检验进行比较分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氧化白藜芦醇在体外对各个细胞株的IC50值

表1　氧化白藜芦醇体外对肿瘤细胞生长抑制作用

从表1可以看出,氧化白藜芦醇体外对各种肿瘤细胞有生长抑制作用

2.2 氧化白藜芦醇体内抑制小鼠S180肉瘤的作用

表2　氧化白藜芦醇抑制小鼠S180肉瘤的作用(±SD,n=10)

表2　氧化白藜芦醇抑制小鼠S180肉瘤的作用(±SD,n=10)

注:与阴性对照组相比**P<0.01;*P<0.05。

组别　　剂量mg·kg-1体重(g)给药前　　给药后瘤重(g)抑瘤率(%)阴性对照组　- 21.44±2.84 35.13±4.31 1.53±0.72　 -环磷酰胺组　60 21.43±1.88 28.32±2.75*0.21±0.10**81.69高剂量组 　80 20.28±2.72 33.19±3.67 0.34±0.11**77.78中剂量组 　40 21.79±1.43 34.09±4.12 0.59±0.19*61.43低剂量组 　20 21.50±2.43 35.89±4.62 0.94±0.45*38.56

由表2可以看出,氧化白藜芦醇在高(80 mg·kg-1)、中(40 mg·kg-1)、低(20 mg·kg-1)三个剂量组下均表现出对小鼠S180移植瘤具有抑制作用,且呈现一定的量效关系,实验药物组肿瘤的平均重量明显低于阴性组;氧化白藜芦醇在高、中、低三个剂量组作用后的肿瘤抑制率分别为77.78%、61.43%和38.56%,且结果与阴性组相比均具有统计学差异,P<0.05。实验结果中,阳性药环磷酰胺组抑制肿瘤效果表现良好,表明实验结果具有可靠性。

2.3 氧化白藜芦醇对荷瘤小鼠的免疫器官的影响

表3　氧化白藜芦醇在荷瘤小鼠的免疫器官的影响(±SD,n=10)

表3　氧化白藜芦醇在荷瘤小鼠的免疫器官的影响(±SD,n=10)

注:与阴性对照组相比,**P<0.01,*P<0.05。

组别　　剂量mg·kg-1体重(g)给药前体重(g)给药前胸腺指数mg·g-1脾脏指数mg·g-1阴性对照组　-　 21.44±2.84 35.13±4.31　 2.34±0.59　 12.95±5.34环磷酰胺组　60　 21.43±1.88 28.32±2.75*1.74±0.43**9.67±2.13*高剂量组 　80　 20.28±2.72 33.19±3.67　 2.14±0.37　 10.98±2.18中剂量组 　40　 21.79±1.43 34.09±4.12　 2.17±0.49　 10.89±2.59低剂量组 　20　 21.50±2.43 35.89±4.62　 2.06±0.82　 13.64±3.84

由表3可以看出,环磷酰胺组小鼠的胸腺指数和脾脏指数与阴性对照组比较有显著性差异,而氧化白藜芦醇高中低剂量组的胸腺指数和脾脏指数与与阴性对照组比较无显著性差异。说明氧化白藜芦对免疫器官的抑制作用不严重

3 讨论

氧化白藜芦醇是白藜芦醇的衍生物。白藜芦醇的抗肿瘤作用已得到广泛的研究[1],白藜芦醇具有抗炎、抗氧化、抗衰老、预防心脑血管疾病等作用,同时发现白藜芦醇可减轻化疗药物的外周神经毒性和肝脏毒性作用,常被用作肿瘤化疗的辅助用药。另外,在多种类型的肿瘤细胞中,白藜芦醇具有放疗增敏的作用。而目前因其抗肿瘤的作用日益受到国内外研究者的关注。国内外多项研究表明,白藜芦醇对鼻咽癌、肺癌、肝癌、肠癌、胃癌、乳腺癌、白血病、甲状腺癌等均有拮抗作用,但由于白藜芦醇的水溶性较差,成药较难,为此水溶性较好的氧化白藜芦醇的抗肿瘤作用得到了一定的研究,2010年Huang等报道,氧化白藜芦醇的衍生物于人口腔表皮样癌细胞,人乳腺癌细胞以及肺癌细胞等均表现出细胞毒性作用,并且其效力等同于阿霉素及玫瑰树碱[7],提示氧化白藜芦醇在抗癌方面的应用潜能。本研究从氧化白藜芦醇在体内外抑制肿瘤细胞株的增殖作用入手,继而测试其对小鼠的肉瘤抑制作用,通过MTT实验发现氧化白藜芦醇具有较好的体外抗肿瘤细胞增殖作用,能在较低浓度下抑制不同人肿瘤细胞的生长作用,建立移植性S180小鼠模型评价了氧化白藜芦醇体内抗肿瘤作用,结果显示氧化白藜芦醇在体内也能产生较好的肿瘤生长抑制作用,且较阳性药环磷酰胺对小鼠免疫脏器及体重影响较小。关于氧化白藜芦醇的抑制肿瘤的生长作用机制,我们发现它有诱导凋亡和自噬的作用(本文没显示数据),其详细的作用机制仍在进一步研究中。我们相信随着对氧化白藜芦醇的研究越多,其成药的可能性越大。

参考文献

1 Jang M,Cai L,Udeani GO,et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol,a natural product derived from grapes[J].Science, 1997,275(5297):218-220.

[2] Schwingel TE,Klein CP,Nicoletti NF,et al.Effects of the compounds resveratrol,rutin,quercetin,and quercetin nanoemulsion on oxaliplatin-induced hepatotoxicity and neurotoxicity in mice[J]. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol,2014,387(9):837-848.

[3] 杨壹羚.白藜芦醇在肿瘤放疗增敏机制中的研究进展[J].中国实验诊断学,2014,18(5):861-863.

[4] 白杨,潘隽丽,苏薇薇.白藜芦醇与白藜芦醇甙的研究进展[J].中药材,2004,27(8):55-58.

[5] Shin A,Davis FB,Lin HY,et al.Resveratrol induces apoptosis in thyroid cancer cell lines via a MAPK-and p53-dependent mechanism [J].J Clin Endocrinol Metab,2002,87(3):1223-1232.

[6] 田雪梅,张展霞.白藜芦醇抗肿瘤作用的体外实验研究[J].中山大学学报:自然科学版,2000,39(6):64-68.

[7] Huang HL,Chen GT,Lu Z,et al.Identification of seven metabolites of oxyresveratrol in rat urine and bile using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Biomed Chromatorgr,2010,24 (4):426-432.

临床论著

Study on tumor cell proliferation activity of oxyresveratrol in vitro and in vivo

Chen Xia-Jing1,Xiong Yao2,Ren Wei2,Xu Ke2,Zhou Li-Ming2△
(1.Department of Pharmacy,Chengdu Women& Children's Center Hospital,Sichuan Chengdu 610091; 2.Department of Pharmacology,Preclinical and Forensic Medical School,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041)

Abstract Objective:To investigate the inhibitory effect of oxyresveratrol on cancer cell line and sarcoma S180 of mouse.Methods:MTT assay was used to detect the inhibitory effect of oxyresveratrol on human cancer cell line proliferation in vitro.Sarcoma S180 of mouse model was performed to observe the anti-cancer activity of oxyresveratrol in vivo.Animals were divided into five groups including:negative control group,CTX group and three groups treated with oxyresveratrol at the dose 80,40,20 mg·kg-1. The inhibitory effect of oxyresveratrol in vivo was evaluated by tumor size and inhibitory rates.Results:MTT assays showed that the IC50of oxyresveratrol for the K562,SK-OV-3,MCF-7,SMMC-7721,A549,HNE-1 and SW-480 were 52.88±3.21, 11.55±5.42,23.61±2.13,58.13±4.8,7.44±2.94,67.73±7.23和62.86±5.2μg·ml-1 respectively.Oxyersveratrol of 80,40, 20mg·kg-1had significant inhibitory effects and dose-dependent effects on growth of tumor,the inhibitory rates of tumor were 77.78%,61.43%(P<0.01),61.43%(P<0.05)and 38.56%.Oxyresveratrol have obvious anti-tumor activities both in vivo and in vitro.

(收稿日期：2015-10)

通讯作者:△周黎明,女,教授,主要从事抗肿瘤药物研究,Email: zhou108@163.com。

作者简介:陈夏静,女,主要从事临床药学工作,Email:93430478@qq. com。