测定分析儿茶酚胺类物质方法的研究进展

李博李川松(.四川省成都中医药大学,四川成都 6004; 2.四川省人民医院,四川成都 6003)

测定分析儿茶酚胺类物质方法的研究进展

李博1李川松2△
(1.四川省成都中医药大学,四川成都 610041; 2.四川省人民医院,四川成都 610031)

摘要儿茶酚胺类物质是一种被广泛研究的神经介质,具体种类包括去甲肾上腺素、肾上腺素、异丙肾上腺素、多巴胺、丁羟色胺、5羟色胺及其衍生物。儿茶酚胺类物质在体内调节基本生理功能,传递生理信号,是正常生理过程中重要的信号介质,同时在病理过程中也出现其含量的相应变化。儿茶酚胺类物质在血浆及组织间液中含量非常微少,同时各类生物样品中存在化学结构与儿茶酚胺相似的代谢物和/或内源性带有相关基团的干扰物,导致精确测定儿茶酚胺含量困难,而临床实践中选择高选择性、高灵敏度测定儿茶酚胺类浓度的方法,不但有着重要的临床意义,也是当前的研究难点。本文在此介绍几种目前应用的检测儿茶酚胺的方法,对高效液相色谱法联合质谱分析做一重点介绍。

关键词:儿茶酚胺;分析检测;高效液相色谱法;毛细管电泳法;质谱

Research progress in the determination of the methods of catecholamine

Li Bo1,Li Chuan-song2△
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 610031; 2.Sichuan People's Hospital,Sichuan Chengdu 610031)

儿茶酚胺类物质具体种类包括去甲肾上腺素、肾上腺素、异丙肾上腺素、多巴胺、丁羟色胺、5羟色胺及其衍生物,儿茶酚胺类物质在体内调节基本生理功能,传递生理信号,是正常生理过程中重要的信号介质,同时在病理过程中也出现其含量的相应变化。临床上可以用于辅助诊断高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤等内分泌相关疾病。儿茶酚胺物质的化学结构特点是:带有一个双羟基苯核和一个带氨基的侧链,在生物样品中儿茶酚胺类物质含量极低,多数文献报道实际生物样品中儿茶酚胺含量极微,儿茶酚胺物质活性的稳定性极差,极易氧化,此外加上生物样品中同时存在的各种结构相似和/或带有相同化学集团的代谢产物的内源性化学干扰物,导致了生物样本中儿茶酚胺浓度精确测定的困难,高选择性且高灵敏度地测定生物样本中某一种特定的儿茶酚胺类物质,例如精确测定血清中去甲肾上腺素和/或肾上腺素,是目前临床尚难以达到的目标[1]。目前国内外关于儿茶酚胺类物质的含量检测分析的相关研究在不断深入,更加关注简单易行,经济适用,精确定量相关物质并且可以广泛适用的方法。生物样本中中儿茶酚胺类物质的相关检测分析方法被广泛报导,这些方法以高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)为主,毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)、荧光光度(Fluorophotometric,FL)、电化学检测(Electrochemical Detection, ECD),特别是质谱(Mass Spectrometric,MS)用得很少[2]。本文总结了国内外学者对儿茶酚胺类物质精确分析检测方法的研究进展,希望能从中筛选测定精确,方便在临床推广的方法。

1 高效液相色谱法联合检测儿茶酚胺

高效液相色谱法是六十年代末七十年代初发展起来的一种分析分离技术,这项技术结合了经典液相色谱法与气相色谱法的工作原理,由于方便快速精确的特点,快速成长为实验室常规分析检测技术之一。高效液相色谱法在各类微量样本物质的检测中被广泛使用,同时因其高分离效率而在临床以及实验室中受到重视。在临床实践过程中,HPLC是分析检测血浆中或者其他生物样本所含激素的常用方法,常用的检测器包括紫外可见、荧光检测器和质谱检测器等。HPLC同ECD和FL相结合十分普遍,最近HPLC同MS和CL的联用也慢慢开始发展。

1.1 HPLC-ECD

陆春苓等使用萃取法提取生物样本中的相关儿茶酚胺类物质,使用高效液相色谱联合电化学检测法(HPLC-ECD)进行精确定量,测得流动相为0.1mmol·L-1Na H2PO4水溶液含0.85mmol·L-1OSA,0.5 mmol·L-1EDTANa2和11%甲醇,用浓磷酸调定p H至3.25,测定儿茶酚胺类物质回收率、线性范围、精密度及最低检测限,同时精确测定并比较了大鼠和小鼠血浆中儿茶酚胺类物质的浓度。作者认为HPLC-ECD法用于检测大鼠和小鼠血浆中儿茶酚胺类物质的水平具有简单快捷、准确度高的特点,该方法适用于精确测定血浆中儿茶酚胺类物质浓度[3]。李静娜等建立起高效液相色谱联合电化学法来测定人血清中的儿茶酚胺类物质,该方法运用高效液相色谱分离出目标物质,联合电化学检测器检测儿茶酚胺,氧化铝固相萃取法测定相关物质,测定方法最低检出限。作者认为高效液相色谱电化学法能精确测定人血清中的相关儿茶酚胺物质,该方法使用生物样本较少,同时检出灵敏度高,回收率和重现性良好,流程方法操作方便快捷,结果准确可靠[4]。

1.2 HPLC-FL

赵燕燕等建立了一种将同步荧光法和双波长法结合起来测定相关儿茶酚胺的方法,对肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺这3种儿茶酚胺的衍生物分别进行同步荧光检测扫描,检测分析了影响荧光强度的因素种类,肾上腺素和去甲肾上腺素的相互干扰可通过双波长法消除,血浆样品可以经酸性正丁醇和正庚烷进行处理,作者认为该法能进行血浆中儿茶酚胺类神经递质的测定[5]。HPLC-FL也适用于对细胞外和大脑样品中儿茶酚胺类物质的分析。儿茶酚胺类物质本身有自然发散荧光,样品处理后能够直接进行荧光检测。儿茶酚胺自然荧光较弱,需将样品衍生化后再检测以提高检测灵敏度,采用的衍生化方法主要有两种,分别为柱后衍生化和柱前衍生化[1]。作者认为HPLC-FL能够高灵敏度的检出生物样本中的儿茶酚胺类物质,可以适用于临床。

1.3 HPLC-MS/MS

由于样本血浆的基质较为复杂,而且其中的待测物含量较低,因此用质谱检测器来检测其中成分的含量是最合适的,质谱检测器用的紫外可见光比荧光具有更强的定性能力和更高的灵敏度,采用质谱检测可以减少基质干扰的影响、提高方法定性和定量的准确性。MS检测可提供有用的结构信息,比普通的紫外检测选择性更好。串联质谱法可以分为两类:空间串联和时间串联。质谱空间串联是联合使用两个以上的质量分析器,两个分析器间建立起一个碰撞活化室,用来打碎前级质谱仪分离选定的离子,并传递用于后一级质谱仪分析。而时间串联质谱仪只有一个分析器,分两个时间段来进行的,前一时刻选定一离子,在分析器内打碎后,后一时刻再进行分析。HPLC分离样品中的相关目标物,一级MS是对HPLC谱图中的各峰进行质谱分析,随后二级MS对一级MS中不确定的峰再一次进行解离分析以确定一级MS的结构。

李博等将HPLC-MS/MS测量血浆儿茶酚胺类物质应用于临床,收集并确诊的恶性口腔肿瘤患者病例40例,良性肿瘤患者病例35例,恶性肿瘤配偶18例,应用症状自评量表按照评分标准,测评每位受试者精神心理状况,同时入院次日上午9点抽取受试者全血并分离提取血清,用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS/MS)分析血清中相关儿茶酚胺以及糖皮质激素含量,结果表明HPLC-MS/MS方法能精确测量患者血浆中儿茶酚胺的含量,适用于人血浆儿茶酚胺的快速分析[6-8]。

质谱分析先将物质离子化,按照离子的质荷比进行分离,然后测量各种离子谱峰的强度来实现分析目的的一种分析方法。质谱的样品一般先要汽化,再经过离子化,含杂质较多的的样品要用色谱和质谱联用仪,是通过色谱进样,即色谱分离,质谱是色谱的检测器。分子进入质谱后,经过处理成为不同质荷比的离子,这些离子按照不同质荷比先后进入检测器得到响应信号,并在电场和磁场的综合作用下,按照其质量数m和电荷数Z的比值(m/z,质荷比)大小依次排列成谱被记录下来,以检测到的离子信号强度为纵坐标,离子质荷比为横坐标所作的条状图就是质谱图。基于色谱和质谱的仪器灵敏度大致相同,加之使用分离效果较好的色谱来作为质谱的进样器,而让快速、高效率、应用广泛的质谱仪作为色谱的鉴定器,使它们成为到目前为止实际效果最好的用于分析微量有机混合物的仪器。质谱-质谱法的迅速发展是在70年代后才开始的。它用质谱作质量分离的质谱技术。可以研究母离子和子离子之间的关系,让大的离子进一步裂解为更小的离子,以便获得裂解过程及离子组成的信息。MS/MS型质谱检测器对于一般质量只有几百的离子,其测量误差<0.003质量单位。HPLC-MS/MS模式干扰也最低,一般用于定量分析。

2 毛细管电泳联合检测法

毛细管电泳原理简单,方便易行,是一种高效灵敏的分离分析方法。目前,毛细管电泳技术用于儿茶酚胺类物质的分析主要联合采用紫外-可见光谱、MS和ECD等检测方式。然而生物样品成分往往复杂,包含内源性或者外源性的干扰物,实际样品的获取常常需要经过渗析、离心及固相微萃取等预处理后才能用于毛细管电泳分析。Tornkvist研究小组采用毛细管多孔石墨碳(Porous graphitized carbon)柱并以60%甲醇-40%甲酸胺缓冲液(p H=2.19)作为流动相,对脑组织中的相关儿茶酚胺类物质进行分离鉴定,并采用质谱检测。由于溶液的p H对样本分离和结果检测有很大的影响,因此选择合适的p H是本实验成功与否的关键[9]。王贤亲等采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm,150 mm,5 Lm)柱子,柱温25℃,流动相为V(乙腈)BV(0.1%甲酸溶液)= 10:90,流速0.6 m L· min-1,进样量20μL;电喷雾离子源(ESI),正离子检测,采用多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)方式对样本进行定量分析。肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺的最小检测限在4.3、2.4和6.6 ng·m L-1之间,浓度在0-500 ng·m L-1范围内线性良好,平均回收率在85.8%-93.4%之间,表明该方法专属性强、灵敏及准确,适用于人血浆儿茶酚胺类物质的快速分析[10]。

3 结语

儿茶酚胺类物质作为类神经递质与人们的健康和疾病联系紧密,越来越多的证据显示了其在生理过程、疾病发生以及疾病进展扮演了不同的角色。已经有许多临床工作者以及科研人员重视对儿茶酚胺类物质的研究,而现阶段最要的研究目标正是如何快速精确定量检出目标物质。要得到准确结果的前提是选择简单可靠的分析方法,目前在实验室应用的检测儿茶酚胺类物质方法各种各样,目前学者们集中报道高效液相色谱同电化学检测、荧光光度检测相结合是分析儿茶酚胺类物质的方法。目前这几种方法各有优劣,高效液相色谱-电化学方法的分析特点在于能减少但不能彻底消除药物干扰。由于许多分析方法在灵敏度、选择性及分析速度等方面达不到样品分析的要求,从而不能在临床上推广应用。近几年发展起来的高效液相色谱-串联质谱技术大大提高了灵敏度与特异性,能快速检测尿样与血样中的儿茶酚胺类物质,其灵敏度与特异性已经足够用于探测大多数与儿茶酚胺类物质相关的肿瘤。发展在线样品预处理、高通量、高灵敏的分析方法是未来几年该领域的发展方向。

参考文献

1 顾群,石先哲,许国旺.生物样品中儿茶酚胺类物质分析方法的研究进展[J].色谱,2007,25(4):457-462.

2 Nikolajsen RP,Hansen AM,Bro R.Attempt to separate the fluorescence spectra of adrenaline and noradrenaline using chemometrics [J].Luminescence,2001,16(2):91-101.

3 陆春苓,周文霞,程军平,等.离子对萃取和高效液相色谱-电化学检测法测定血浆中儿茶酚胺[J].军事医学科学院院刊,2004,28 (3):275-277.

4 李静娜,梁高道,朱其明,等.高效液相色谱电化学法测定人血清中的儿茶酚胺及5-羟色胺含量[J].中国卫生检验杂志,2009,19(8): 1722-1724.

5 赵燕燕,苏芳,王翠玲,等.同步荧光-双波长法同时测定血浆中儿茶酚胺类神经递质[J].河北大学学报(自然科学版),2008,28(1): 63-68.

6 李博,李黎,黄一冰,等.口腔肿瘤患者心理压力与体内相关因素变化的初探[J].口腔颌面外科杂志,2013,23(5):369-373.

7 李博,李黎,郭黛墨,等.儿茶酚胺水平与口腔鳞癌患者精神心理因素变化的关系[J].上海口腔医学,2013,22(6):671-675.

8 李博,李黎,段泽西,等.口腔肿瘤患者精神心理因素评估及相关物质基础的初步研究[J].华西口腔医学杂志,2013,31(6):1-7.

9 Törnkvist A,Sjöberg PJ,Markides KE,et al.Analysis of catecholamines and related substances using porous graphitic carbon as separation media in liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2004,801 (2):323-329.

10 王贤亲,虞慧畅,林丹,等.液相色谱-串联质谱法测定人血浆中儿茶酚胺的含量[J].分析试验室,2008,27(Z1):157-159.

教学研究

(收稿日期：2015-8-23)

通讯作者:△李川松,男,副主任药师,主要从事医院药学研究,Email:409399326@qq.com。

作者简介:李博,男,大学在读,主要从事微量物质的精确检验,Email:lb2033@126.com。