液相色谱串联电化学检测器测定人体血浆和尿液儿茶酚胺浓度

王玲　阳愿望

【摘要】目的：建立一种简便、快速、灵敏、准确的测定人体血浆、尿中儿茶酚胺的方法，为临床检测和研究提供技术支持。方法：采用活性氧化铝（AL₂O₃）对血浆和尿液标本中的儿荼酚胺进行酸解吸附、净化，利用离子对反相高效液相色谱串联电化学检测器法（RP-HPLC-ECD）对其测定，工作电压+0.80V，灵敏度50nA，以外标法定量。结果：去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺分离良好，出峰时间分别为8分钟、9分钟、11分钟，且不受体内其他内源性物质及代谢物干扰。样本在2.0-100ng/ml浓度范围内有良好线性关系，分离参数R≥1.5，其方法绝（相）对回收率分别为82.5-104.4%、83.4-100.7%、77.0-91.8%，最低检测浓度1.0ng/ml。结论：RP-HPLC-ECD检测人体血浆、尿中儿茶酚胺具有操作简便，分析快速，特异性高，重复性好的优点。

【关键词】儿茶酚胺；反相高效液相色谱；嗜铬细胞瘤

单胺类神经递质儿茶酚胺类（Catecholamines，CAs）化合物，主要包括去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、多巴胺（DA）。它是人类中枢神经重要的信息传递物质，不仅直接参与植物神经功能的调控，还与许多功能型疾病有关。血浆和尿液中的CAs含量不但可作为嗜铬细胞瘤的诊断依据，而且可应用于其他与儿茶酚胺有关疾病的研究，对研究这类神经递质的生理功能及其代谢变化具有重要意义。传统的荧光法与放射免疫测定法（Radio-immunassay，RIA），气相色谱法（GC），或步骤繁琐，或价格昂贵不易实现。由于电化学检测器的高灵敏度，使该类化合物体内微量分析得以应用。本文建立的RP-HPLC-ECD测定人体血浆及尿中的儿茶酚胺，具有方法简单，快速，专一，在应用中重复性较好，适用于临床测定及研究人体内儿茶酚胺的代谢分析。

1仪器与材料

1.1仪器

美国Waters e2695型高效液相色谱系统、Waters2465电化学检测器及Empower2色谱数据处理工作站。XW-80A旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），DL-8M低速冷冻离心机（上海市离心机械研究所有限公司）。

儿茶酚胺（NE、E、DA）标准品（Sigma公司）；AL₂O₃、Tris进口分装；甲醇、乙腈、冰乙酸、EDTA-Na2、B8（辛烷磺酸钠）以上均为进口色谱纯；浓盐酸、无水NaAc为国产优级纯或分析纯试剂，试验用水为娃哈哈596ml装饮用纯净水。

2方法与结果

2.1标准溶液的配制

准确称取NE、E、DA标准品用0.1mol/L HCL配制成1μg/ml的CAs混合标准溶液，分装后置于-70℃冰箱长期保存。临使用时用0.1mol/L HCL溶液稀释成终浓度分别为100.0、50.0、20.0、5.0、2.0ng/ml五个浓度梯度。

2.2 Tris-HCL缓冲液的配制

称取Tris 12.114 g用0.1mol/HCL溶解配制成1.OmoFl Tris-HCL缓冲液，调PH值至8.9。

2.3氧化铝的活化

参照Anton等方法，称100g氧化铝于1000ml烧杯中，加2moFl HCL 500ml，90℃搅拌45min，冷却，弃上清液及悬浮粒；加2mol/l HCL 250ml，70℃搅拌10mm，冷却，弃上清液及悬浮粒，共两次；加2mol/1 HCL 500ml，50℃搅拌10mm，冷却，弃上清液及悬浮粒；反复用纯水200ml/次，洗涤至PH≈3.4。将氧化铝转至蒸发皿，120℃烤1h，200℃烤2h，冷却后在室温下干燥贮存。每次做试验前取部分氧化铝200～C烤2h进行活化，冷却至室温，后称活化的氧化铝20mg/管至15ml塑料刻度试管中备用。

2.4色谱条件

分析柱，C18柱（Hypersil ODS2 5μm4.6*250mm，大连依利特科学仪器有限公司）。流动相：无水NaAc4.1g，EDTA-Na250mg，B8 80mg，冰乙酸7.5ml，乙腈80ml，加试验用水至1000ml，调节PH值至4.2，0.22μm滤膜过滤后超声脱气。流速0.45ml/min；电化学检测器工作电压+0.80V，Ag/AgCL为参比电极，Range=50 nA，柱温40℃。此条件下NE、E、DA分离良好，如图1a，图1b所示。

2.5样品处理

2.5.1标本收集

血浆标本，宜在空腹卧床休息30min后抽取静脉血，EDTA抗凝，4℃3500r/min，立即离心5分钟，分离血浆后置-20℃冻存，检测时室温复融；尿液标本，在容器中以5-10ml浓盐酸作防腐处理，收集24小时尿并记录尿量，混匀，取10ml置-20℃冻存，检测时室温复融。

2.5.2样品处理

在2.3项下已加入活化氧化铝的15ml塑料刻度试管内加入0.4ml Tris-HCL缓冲液，取抗凝血，离心分离血浆1-2ml（离心后的尿液0.2ml），旋涡振荡15min，使儿茶酚胺吸附在氧化铝上，离心10min，弃上清液，沉淀用5ml试验用水（预冷）洗涤4次，离心，小心用棉签尽量吸干水相，沉淀加入0.2 mol/l的HCL 0.2 ml，旋涡振荡15min，将吸附于氧化铝上的儿茶酚胺解析下来，离心，取20lxl洗脱液用于进样，根据外标法定量。

2.6结果

2.6.1标准曲线的制备

血浆：分别取空白血浆1.0ml及空白尿样0.2ml置15ml塑料刻度试管内，将标准储备液用0.1mol/HCL溶液稀释成如“2.1标准溶液的配制”项下的标准工作液，混匀后照“2.5.2样品处理”项下操作，进样，以外标法峰面积对浓度进行线性回归。CAs浓度在2.0-100ng/ml浓度范围内线性良好，结果如表1示。

2.6.2精密度和重复性

取同一浓度标准品分多次在相同的试验日和不同的试验日测定，得方法重复性；按处理方法反复测定得日内变异系数（n=20）为1.44～2.48%，日问变异系数（n=20）为3.51～7.63%。结果如表2示。

2.6.3方法回收率

取空白血浆、尿液作基质，用配成的（低、中、高）三种浓度分别为5.0、10.0、50.0ng/ml的标准液分别加样，按样品处理方法处理测定，用实测浓度比加入浓度即得回收率。结果如表3所示。

3讨论

（1）本实验采用酸性活化氧化铝萃取的方法进行生物样品中的儿茶酚胺类化合物提取，活化效果满意，回收率与文献报道相近。

（2）色谱系统检测条件设置多样，其中色谱柱种类、柱效、流动相PH、离子对浓度、有机相比例等都是影响儿茶酚胺分离和定量的重要因素吲。本法取C18材料反相离子对色谱柱，流动相PH4.2，乙腈8%，分离和检测效果良好。采用国产色谱柱大幅降低成本。

（3）本法样品回收稳定，峰图分离完全，检测电化学反应呈良好线性关系和重现性，回收率分别为82.5-104.4%、83.4-100.7%、77.0-91.8%，回收率较高，精密度<8%，最低检出限达40pg，全部峰图在12分钟内出齐，表明本法具良好特异性、稳定性和灵敏性，检测速度也较宽，线性范围（2.0-100ng/ml）较宽，能满足临床需求。

（4）对本实验样品的要求及固相萃取前处理时的一些注意事项：本实验对血浆标本要求严格，抽取静脉血后应立即在低温条件下分离血浆并即时送检，-20℃冻存待测，避免反复冻融。标本送检不及时或未立即分离血浆对结果有较大影响，脂浊标本对氧化铝萃取分离（导致回收率降低）和检测结果均有影响。由于NE、E、DA有两个邻位酚羟基，极易被氧化，而且氧化剂、热、光、碱都会加速其氧化分解，故有条件时应在避光及低温条件下进行操作处理样本。

（5）对制备好的实验样品的保存及降解情况作统计，证实样品在48h之内无论4℃存放还是-70℃，其含量变化不大，72h后含量变化有统计意义。因此制备好的样品在3d内检测比较准确。