丹参酮IIA对阿尔兹海默病作用机制的研究进展*

朱杰君 万莉红(四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室,四川成都 610041)

丹参酮IIA对阿尔兹海默病作用机制的研究进展*

朱杰君 万莉红△
(四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室,四川成都 610041)

摘要丹参酮IIA是中国传统药物丹参的脂溶性提取物,临床上广泛用于感染性疾病和脑心血管疾病的治疗,在阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)体内外模型中也显示出了一定的治疗效果。其主要是通过抑制淀粉样蛋白(beta-amyloid protein, Aβ)的形成和沉淀,抑制Tau蛋白的过磷酸化,从而抑制老年斑(Senile plaques,SP)的形成和神经纤维的缠结(Neurofibrillary tangles,NFT);抑制抗氧化应激,通过多种途径抑制神经元凋亡;此外,丹参酮IIA还显示了抗胆碱酯酶的作用、神经保护和修复作用,从而对AD起到防治作用。

关键词:丹参酮IIA;Aβ蛋白;Tau蛋白;氧化应激;凋亡

Research progress of the mechanism of tanshinoneⅡA on alzheimer’s disease*

ZhuJie-jun,Wan Li-hong△
(Department of Pharmacology,West China School of Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041)

阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种常见于老年和老年前期的神经退行性疾病,主要病理学改变为大量的老年斑(Senile plaques,SP)、神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFT)形成以及神经元的广泛缺失。临床上以进行性记忆障碍为主要特征,对患者的生活质量和自理能力有严重影响[1,2]。近年来,人口老龄化使AD患病率呈急剧升高趋势,据推测,至2025年美国AD患者将有望达到1.38亿,几乎为2000年AD患者的3倍[3,4]。急剧增长的AD患者数目和目前临床上有效治疗手段的缺乏,给社会医疗和社会经济带来巨大压力[5]。因此针对该疾病的病理特征和疾病进展进行更有针对性的治疗方案的探索仍然是当今世界的热点课题之一。

丹参最早记载于《神农百草集》,为中国传统药物,用于活血祛瘀,通经止痛,清心除烦,凉血消痈等。丹参为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhizaBge)的干燥根及根茎,其主要化学成分可分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类,此外还有甾醇类、三萜类等其他成分[6]。其中丹参酮IIA的药理作用广泛,目前临床上广泛使用于感染性疾病、心血管疾病的治疗,在体内外AD模型中也展现了一定的治疗效果[7]。本文关注对丹参酮IIA在AD疾病模型中作用及机制,希望给临床和基础研究提供参考。

1 抑制Aβ蛋白的形成和聚集

Aβ蛋白含39-43个氨基酸残基,由淀粉样前体蛋白(Amyloid protein precursor,APP)体内代谢生成。APP在β分泌酶的作用下生成包含Aβ的C末端片段(Aβ-containing C-terminal fragment,CTFβ),CTFβ在γ分泌酶的作用下生成单体的具有可溶性的Aβ[8]。单体的Aβ聚集形成多β螺旋结构的寡聚体,进一步聚集则形成原纤维和淀粉样纤维,Aβ的寡聚体及淀粉样纤维容易沉积在基底核、海马、新皮层等区域,且聚集后不易溶解,逐渐累积而产生SP[9]。Aβ寡聚体和原纤维对神经细胞的毒性作用很强,涉及到破坏细胞内的Ca2+稳态,促进自由基的形成,增强致炎细胞因子引起的炎症反应等分子机制,最终引起突触障碍和神经元死亡[10]。相反的,如果APP在α分泌酶位点切断,那将生成s APPα(a secreted fragment of APP released by the action ofα-secretas)和CTFα(C-terminal fragmentreleased by the action ofα-secretas),对神经元不产生毒性[11]。而且s APPα还显示了多种神经保护和神经营养作用,例如增强长时程增强(Long-term potentiation,LTP)、调节突触形成[12,13]。

Wang等人发现丹参酮IIA可以阻止Aβ寡聚体的进一步聚集以及一定的逆转原纤维的能力。分子动力学模拟(Atomic force microscopy,AFM)发现丹参酮IIA可与Aβ寡聚体多个结构域结合,特别是C端I31-M35、M35-V39、N端的芳香基以及U-turn结构域,从而抑制Aβ寡聚体的进一步聚集。除了抑制寡聚体的聚集,硫黄素T(Thioflavin-T,Th T)荧光分析和AFM结果还显示了丹参酮IIA对成熟Aβ的解聚作用[14]。多种丹参提取物及提取物的复合物,都显示了对Aβ形成和聚集过程的抑制作用。将pcDNA3.1/ APP595/596转染的HEK293细胞孵育24小时的复方丹参酮后,细胞APPmRNA水平显著低于多奈哌齐[15]。体内外实验都显示,给予丹参酮IIA的前体药物隐丹参酮可以显著增加sAPPα和CTFα,增强α分泌酶活性,进而降低Aβ的沉积和斑块形成,增强APP/PS1小鼠学习记忆能力[16]。

2 抗Tau蛋白过度磷酸化

Tau是AD及部分神经退行性疾病中神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFT)的主要组成成分[17,18]。正常情况下, Tau与细胞骨架和形态相关,通过磷酸化和去磷酸化维持细胞的正常形态和胞内物质转运。当Tau过度磷酸化,将形成双螺旋纤维,细胞微管结构和细胞骨架受到破坏,进而引起细胞凋亡[19-21]。

Tau蛋白的磷酸化受多种激酶调节。最早从脑中提取的Tau蛋白激酶为TPKII(Tau protein kinases-II),由细胞周期依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependentkinase 5,Cdk5)及其激活剂组成的蛋白激酶[22]。与其它Cdk相似,Cdk5的活性依赖于特定的调节亚基,包括p35及其异构体p39[23]。研究表明Cdk5能使tau等多种细胞骨架蛋白磷酸化[25],参与阿尔茨海默病的发病和进展[24]。近期研究发现,丹参酮IIA可以抑制p35裂解为p25,从而抑制p25对Cdk5的结合和活化;同时,丹参酮IIA还可抑制p25/Cdk5从胞核向胞质转移,从而抑制对p25/Cdk5 对Tau的过度磷酸化,改善细胞的超微结构[26]。

Tau蛋白的磷酸化还受糖原合成激酶3(Glycogen synthasekinase 3,GSK3)调节。GSK3是一种脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶,可通过磷酸化双螺旋丝(Paired helical filaments,PHF)中的Tau蛋白促进NFT的进展[22]。此外, GSK3β为高危的痴呆基因[27],在AD患者中GSK-3β系统性过度表达。研究表明Aβ可以直接激活GSK3β活性[28,29],而GSK3β的增强既可以促进Aβ的产生和聚集,还促进了Tau蛋白的过磷酸化[30]。因此GSK3在AD的SP和NFT的形成过程起重要作用。而丹参酮IIA可以通过活化PI3K/Akt途径抑制GSK3β磷酸化,对Aβ25-35诱导孵育的PC12起保护作用[31]。

3 抗氧化应激作用

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(Reactive nitrogen species,RNS)产生过多,氧化程度超出氧化物的清除,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致氧化产物堆积、还原酶活性降低,DNA/RNA、蛋白、脂质的过氧化和组织损伤[32]。大量研究结果证明,氧化应激参与了神经退行性疾病的形成过程,可导致神经元凋亡和坏死[33]。

据报道,以30μM的Aβ25-35处理大鼠皮质神经元,会引起超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性降低,谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH-PX)活性降低,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平增加,胞内ROS水平增加,线粒体膜电位(Mitochondrial membranepotential,MMP)降低,细胞活性降低和细胞凋亡相关分子的改变。而不同浓度的丹参酮IIA提前孵育1h,可以降低Aβ引起的氧化产物形成,增加抗氧化酶的活性,提示了丹参酮IIA抑制Aβ引起的氧化应激过程,对神经元其保护作用[34]。

大量资料显示,AD脑中氧化应激和自由基产生与脑内金属离子的失衡密切相关,如Cu2+和Fe+和Aβ结合后可引起自由基的形成[32]。体内外实验显示丹参酮IIA具有维持脑内铁离子稳态的作用,从而保护氧化应激的损伤[35]。

4 维持钙稳态

钙是神经元中重要的第二信使,生理浓度下参与神经元的兴奋传导、代谢活动,是神经元维持正常功能所必需的。而当细胞内Ca2+浓度升高,细胞内发生钙超载、钙稳态失衡,将损伤神经元,最终导致细胞死亡。一些经典实验表明,胞内钙超载、钙稳态失衡是导致细胞死亡和AD最终形成的“最后共同路径”[36,37]。脂质过氧化可以损伤线粒体和内质网膜,损伤的线粒体和内质网或者Aβ的直接刺激使大量Ca2 +进入胞质,引发胞内Ca2+超载,触发凋亡的形成和线粒体的进一步损伤。低剂量Aβ25-35即可引起基底核(nucleus basalis of Meynert,nb M)神经元电压依赖性钙流的显著增加,丹参酮IIA可以阻断这种钙电流的放大[26]。多项研究表明丹参酮IIA通过维持胞内钙稳态,保护谷氨酸、Aβ对PC12的损伤[38,39,40]。

5 抗凋亡

神经元丢失是AD的重要病理学特征,Aβ、线粒体损伤、氧自由基都与凋亡密切相关。Aβ或其他因素引起的线粒体损伤可以导致细胞素C(Cytochrome C,Cytc的释放,从而激活caspase3。体外实验中,用4μm Aβ1-42孵育皮质神经元24 h,可降低皮质神经元存活率至57%,凋亡率增至47%,降低抑凋亡相关基因bcl-2 m RNA和BCL-2蛋白水平。而提前24 h给予丹参酮IIA,凋亡率降至15%,bcl-xl m RNA和BCL-2蛋白水平都显著增高[41]。Liu等人的研究结果也体现了丹参酮II的抗凋亡作用,通过对线粒体的保护作用,降低Cytc向胞质的转移,从而抑制了Cytc对含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)的激活,逆转Aβ引起的BCL-2/BAX的降低[34]。

6 胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase inhibitors, Ach EI)样作用

胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase inhibitors,Ach EI)是目前临床上主要使用的治疗药物,延缓轻度到重度AD患者的疾病进展。

丹参的多种提取物——二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA都显示了一定的胆碱酯酶抑制作用。

丹参酮IIA通过多种方式保护神经元,改善小鼠认知障碍,提示了其在AD治疗上的应用前景,但由于其较低的口服生物利用度和血脑屏障(Blood–brain barrier,BBB)的穿透率,限制了其在AD上发挥更显著的作用[42]。因此充分利用丹参的神经保护作用,关键是增加其生物相似性,增强其吸收分布和BBB穿透能力。Liu等人研究发现阳离子化牛血清白蛋白修饰聚乙二醇丹参酮ⅡA纳米粒(Cationic bovine serum albumin-conjugated tanshinone IIA PEGylated nanoparticles,CBSAPEG-TIIA-NPs),与静脉注射丹参酮ⅡA溶液相比,静脉注射CBSA-PEG-TIIA-NPs可以显著提高大鼠的血药浓度和BBB穿透能力,使丹参酮IIA在脑中富集[43]。Chen等人的研究发现丹参酮IIA的BBB低渗透率可能与P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gP)及多药耐药相关蛋白(Multidrug-resistance-associated protein,Mrp1/2)相关,提示其与P-gP联合使用的可能发挥更好的药理作用[44]。研究还发现丹参酮IIA与其他中药提取物联合使用可以提高其口服生物利用度。例如丹参提取物中的二萜醌类成分能够显著增加丹参酮ⅡA和隐丹参酮的肠吸收[45]。丹参提取物和冰片联合使用时,可缩短丹参酮ⅡA血药浓度达峰时间[46]。通过药代动力学的研究和新剂型的研发以及合理的药物联合使用,我们可以期待丹参酮IIA在临床AD的治疗中发挥更好的疗效。

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(收稿日期：2015-8-26)

通讯作者:△万莉红,女,副教授,主要从事神经药理及炎症药理学研究,Email:wanlihong1976@sina.com。

作者简介:朱杰君,女,硕士研究生,主要从事神经药理研究,Email:jiejunzhu01@126.com。

*基金项目:国家自然科学基金资助(编号:81100989)