稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的建立

张永宁，吴绍强，宋姗姗，董 宣，林祥梅*

(1.中国检验检疫科学研究院 动物检疫研究所，北京 100029；2.山东农业大学 动物医学学院，山东 泰安 271018)

施马伦贝格病是由施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)引起的一种由库蠓传播的家畜传染病[1-2]，主要感染绵羊、山羊和牛等反刍动物[3-4]。该病于2011 年底在德国施马伦贝格镇首次发现，随后蔓延西欧，而且有继续向其他国家传播的趋势。

SBV 归属布尼亚病毒科(Bunyaviride)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)辛波血清群(Simbu serogroup)[1]。SBV 基因组为单股负链RNA，分为L、M 和S 3 个基因节段[1,5]。S 基因核苷酸序列高度保守，编码核衣壳(N)蛋白和非结构蛋白NSs[5]。其中，N 蛋白为SBV 分子生物学和血清学检测的靶基因/蛋白[4]。

作为一种新发生的外来动物疫病，预先开展检测技术储备研究对预防该病传入意义重大。鉴于目前国内尚无SBV 活病毒，无法建立常规的SBV 间接免疫荧光(IFA)检测方法。由于SBV 在BHK-21 和Vero 等细胞系中生长良好，能够产生明显的细胞病变(CPE)，可用于对SBV 的分离、培养以及IFA 检测[1,5-6]。因此，本研究通过慢病毒载体系统将SBV-N基因整合至BHK-21 细胞的基因组中，制备了稳定表达SBV-N 蛋白的BHK-21 细胞系，为SBV 血清抗体的检测提供实验材料。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 SBV(BH80/11-4 株)RNA 和SBV 抗体阳性牛血清R1、绵羊血清R4 分别由德国FLI 病毒诊断实验室的Bernd Hoffmann 博士和Martin Beer 博士惠赠[7]；SBV 抗体阴性牛血清HB826、SBV-N 蛋白单克隆抗体(MAb)2C8、BHK-21和HEK-293T 细胞均由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室制备和/或保存[7]；慢病毒表达载体pLV-EGFP-C、辅助载体pHelper1.0 和pHelper2.0 均购自北京英茂盛业生物科技有限公司。

1.2 主要试剂 AgPath-IDTMone-step RT-PCR kit 购自Life Technologies 公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自OMEGA 公司；Plasmid plus maxi kit、RNeasy®mini kit、PolyFect 转染试剂、RNase-free DNase 购自Qiagen 公司；限制性内切酶、DNA 连接酶、Onestep RNA PCR kit(AMV)购自TaKaRa 公司；HRP 标记的山羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)、TRITC 标记的山羊抗小鼠IgG(IgG-TRITC)、β-Actin MAb、Hoechst 33342、嘌呤霉素均购自Sigma 公司；兔抗牛IgG-TRITC、驴抗绵羊 IgG-TRITC 购自 Immuno Reagents 公司；RIPA 细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所；鼠抗增强型绿色荧光蛋白(EGFP)MAb购自南京钟鼎生物技术有限公司；ECL 化学发光底物试剂盒购自Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 重组慢病毒载体的构建 根据GenBank 中登录的SBV S 基因序列(HE649914)设计了一对用于N基因克隆以及与6×His 标签融合的特异性引物，上游引物：5'-GGTGAATTCATGTCAAGCCAATTCATT TTTGAAGATGTACCACAACGGAATGC-3'(Eco RⅠ)，下游引物：5'-TAAGGATCCTTA ATGATGATGGTGG TGATG GATGTTGATACCGAATTGCTGCA-3'(Bam HⅠ，斜体为6×His 标签编码序列)，预期扩增片段大小为735 bp。以SBV RNA 为模板，利用RT-PCR 扩增SBV-N 基因并与6×His 标签融合。将PCR 产物克隆至pLV-EGFP-C 载体中构建重组慢病毒质粒pLV-EGFP-SBV-N。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.4 重组慢病毒的包装 将HEK-293T 细胞以5×106个/皿的密度接种于培养皿，通过PolyFect 转染试剂将重组慢病毒质粒pLV-EGFP-SBV-N(5 μg)与辅助质粒pHelper1.0(3.75 μg)和pHelper2.0(1.25 μg)共转染HEK-293T 细胞，收集细胞培养上清液，置-80 ℃保存备用。以相同操作步骤，将慢病毒空载体pLV-EGFP-C 与辅助载体共转染HEK-293T 细胞，以制备空载体慢病毒对照。利用流式细胞术测定慢病毒滴度[8]。

1.5 慢病毒感染和细胞筛选 将BHK-21 细胞以5×104个/孔的密度接种于24 孔细胞培养板，将慢病毒储存液作10 倍稀释，并向其中加入终浓度为6 μg/mL 聚凝胺，以其感染BHK-21 细胞，24 h 后更换新鲜培养基，继续培养24 h。将BHK-21 细胞以200～500 个/皿的密度接种于培养皿，加入终浓度为5 μg/mL 嘌呤霉素，每3 d 换液一次，并重新添加嘌呤霉素。筛选2 周后出现细胞克隆，在荧光显微镜下挑取表达荧光信号最强的BHK-21 单克隆细胞株进行扩大培养。

1.6 细胞系的荧光定量RT-PCR 鉴定 利用RNeasy®mini kit 提取约6×106个细胞总RNA，并采用RNase-free DNase 处理RNA 样品以彻底去除细胞基因组DNA 污染。以AgPath-IDTMone-step RTPCR kit 说明配制反应预混液，采用双重荧光定量RT-PCR[9]同步检测SBV-N 基因和β-actin 内参基因在BHK-21 细胞中的表达水平。其中，检测SBV-N基因mRNA 的引物及其Taq Man 探针序列参照文献[9]；检测BHK-21 细胞β-actin 内参基因的引物及其Taq Man 探针则根据仓鼠(Mesocricetus auratus)的基因组序列(AJ312092)进行设计，引物序列为：5'-CAGC ACCATGAAGATCAAGATCATT-3'/5'-CGGACTCATC GTACTCCTGCTT-3'；Taq Man 探针序列为：5'-HEXTCACTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-BHQ1-3'。引物和探针由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.7 细胞系的western blot鉴定 采用RIPA 裂解液提取BHK-21 细胞总蛋白进行SDS-PAGE 分析后转印至PVDF 膜，分别以MAb 2C8(1∶4 000)、EGFP MAb(1∶1 000)、兔抗β-actin 多抗(1∶1 000)为一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶10 000)和山羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000)为二抗，通过ECL 系统显影进行western blot 检测。

1.8 细胞系的IFA鉴定 制备BHK-21 细胞爬片，分别以MAb 2C8(1∶1 000)、SBV 抗体阳性血清R1(1∶100)和R4(1∶100)为一抗、山羊抗小鼠IgG-TRITC(1∶100)、兔抗牛IgG-TRITC(1∶100)和驴抗绵羊IgG-TRITC(1∶100)为二抗对细胞进行荧光染色。利用荧光显微镜进行IFA 检测。

2 结果

2.1 重组慢病毒质粒的构建 以SBV RNA 为模板，利用设计的特异性引物进行RT-PCR 扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示，RT-PCR 扩增得到一条约750 bp 的目的片段(图1)，与预期大小相符。回收PCR 产物，经Eco RⅠ/Bam HⅠ酶切后，克隆至慢病毒载体pLV-EGFP-C 中构建重组慢病毒质粒pLVEGFP-SBV-N。重组质粒测序结果表明，N 基因序列、插入位置以及阅读框均准确无误(图略)。

图1 SBV-N 基因RT-PCR 扩增结果Fig.1 Amplification of SBV-N gene by RT-PCR

2.2 重组慢病毒的包装 利用PolyFect 转染试剂将重组慢病毒质粒pLV-EGFP-SBV-N 与辅助质粒pHelper1.0 和pHelper2.0 共转染HEK-293T 细胞。转染后48 h 收集重组慢病毒，结果显示，未见HEK-293T 细胞出现明显CPE(图略)。流式细胞术测定结果表明，制备的慢病毒滴度约为1.0×107TU/mL。

2.3 稳定表达SBV-N蛋白细胞系的筛选 在聚凝胺的介导下，将重组慢病毒感染BHK-21 细胞，经过嘌呤霉素筛选最终获得一株可稳定表达SBV-N 蛋白的BHK-21 单克隆细胞株，命名为BHK-21-EGFPSBV-N，在荧光显微镜下可见该细胞自发绿色荧光，并且荧光信号呈现点状胞浆分布(图2A)。稳定表达EGFP 的慢病毒空载体对照BHK-21 细胞(命名为BHK-21-EGFP)，在荧光显微镜下可见细胞自发绿色均质的荧光信号，但未见点状聚集(图2B)。表明SBV-N 蛋白在BHK-21-EGFP-SBV-N 细胞中高效表达，并且与EGFP 形成融合蛋白。

图2 BHK-21 细胞系的荧光显微镜分析Fig.2 Identification of the SBV-N expressed in the established BHK-21-EGFP-SBV-N cell line

2.4 细胞系的荧光定量RT-PCR鉴定 以BHK-21-EGFP-SBV-N、BHK-21-EGFP 和BHK-21 细胞的总RNA 为模板进行双重荧光定量RT-PCR 扩增。针对SBV-N 基因的荧光定量RT-PCR 检测结果显示，除BHK-21-EGFP-SBV-N 细胞在Ct 值为14.66±0.25、阳性对照(1 000 倍稀释的SBV RNA)在Ct 值为24.59±0.11 处出现特异性扩增外，BHK-21-EGFP 细胞、BHK-21 细胞和阴性对照均未出现特异性扩增(图3)。针对β-actin 内参基因的荧光定量RT-PCR检测结果显示，BHK-21-EGFP-SBV-N 细胞、BHK-21-EGFP 细胞和BHK-21 细胞在Ct 值10.66±0.63 处均出现特异性扩增(图略)，而阳性对照和阴性对照均未出现特异性扩增(图略)。表明SBV-N 基因的mRNA 在BHK-21-EGFP-SBV-N 细胞内正确表达。

2.5 细胞系的western blot鉴定 提取BHK-21-EGFP-SBV-N、BHK-21-EGFP 和BHK-21 细胞总蛋白，利用抗EGFP、SBV-N 和β-actin 的MAb 对其进行western blot 鉴定。结果显示，BHK-21-EGFPSBV-N 细胞在约50 ku 处出现一条特异性条带，该蛋白既能被SBV 特异性MAb 2C8 所识别，又能与抗EGFP 的MAb 发生反应，表明该蛋白为EGFP 与SBV-N 蛋白形成的融合蛋白(EGFP 大小为26 ku，SBV-N 为26 ku)，SBV-N 蛋白在BHK-21-EGFPSBV-N 细胞中正确表达；而慢病毒空载体对照细胞BHK-21-EGFP 仅在26 ku 处与抗EGFP 的MAb 发生反应，而不能被2C8 所识别；BHK-21 细胞对照无特异性条带(图4)。

图3 SBV-N 基因在BHK-21 细胞系中表达水平的荧光定量RT-PCR 分析Fig.3 Real-time RT-PCR analysis of the expression level of SBV-N gene in the generated BHK-21 cell lines

图4 SBV-N 蛋白和β-actin 内参蛋白在BHK-21 细胞系中表达水平的western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of the expression levels of SBV-N protein and β-actin internal control protein in the generated BHK-21 cell lines

2.6 细胞系的IFA试验 以MAb 2C8、SBV 抗血清R1 和R4 为一抗，山羊抗小鼠IgG-TRITC、兔抗牛IgG-TRITC 和驴抗绵羊IgG-TRITC 为二抗对细胞进行IFA 检测。结果表明，BHK-21-EGFP-SBV-N 细胞胞浆内的绿色点状荧光信号(自发信号)能够与红色点状荧光信号(染色信号)发生共定位，该细胞不仅与2C8 发生特异性反应，而且能够识别SBV 抗体阳性牛血清R1(图5 和6A)，也能够与SBV 抗体阳性绵羊血清R4 发生反应(图略)。但与SBV 抗体阴性牛血清HB826 未发生特异性反应(图6B)。空载体对照细胞BHK-21-EGFP 与2C8 和SBV 抗体阴/阳性动物血清均未发生反应(图5 和图6)。

3 讨论

施马伦贝格病在不到两年的时间里迅速传播至20 多个欧洲国家，有研究证实该病正呈现出全球蔓延态势[10-11]。截至目前，中国尚未出现相关疫情，但我国作为畜牧业生产大国应充分做好应对该病的技术储备工作。

为建立施马伦贝格病的血清学检测方法，必须制备既符合生物安全要求又具有良好抗原性的SBV蛋白。由于哺乳动物细胞自身具备蛋白质折叠和翻译后修饰的功能，因此哺乳动物细胞表达系统被广泛应用于具有生物活性蛋白质的制备[12]。本研究利用慢病毒载体系统将SBV-N 基因整合至BHK-21 细胞基因组内，使SBV-N 蛋白在BHK-21 细胞中稳定表达。为便于后续纯化重组SBV-N 蛋白，本研究在构建重组慢病毒表达载体时，在下游引物的5' 端引入6×His 标签蛋白的编码序列，最终在BHK-21 细胞中获得了C 端带有6×His 标签的SBV-N 融合蛋白，可利用镍柱(Ni-NTA agarose)对该融合蛋白进行亲和纯化。

图5 BHK-21 细胞系与SBV 特异性MAb 2C8 反应性的IFA 分析Fig.5 Detection of the generated BHK-21 cell lines by IFA using the SBV-specific MAb 2C8

图6 BHK-21 细胞系与SBV 抗血清反应性的IFA 分析Fig.6 Detection of the generated BHK-21 cell lines by IFA using SBV antisera

慢病毒作为逆转录病毒的一种，具有广泛的细胞感染谱，对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有高效的感染能力，能够将长片段的外源基因在逆转录酶的作用下高效地整合至宿主细胞的基因组中，并实现长期稳定表达[13]。本研究所使用的慢病毒载体pLV-EGFP-C 属于复制缺陷型病毒载体，具有良好的生物安全性，是一种理想的可用于构建与筛选稳定表达外源基因细胞系的基因转移载体。该载体携带巨细胞病毒(CMV)和磷酸甘油酸激酶(PGK)双启动子，多克隆位点位于EGFP 标签下游，在CMV 启动子驱动下表达EGFP 和外源基因，在PGK 启动子驱动下表达嘌呤霉素抗性基因，因此可筛选稳定表达外源基因的细胞系。此外，由于pLV-EGFP-C 载体携带EGFP 标签蛋白的编码基因，因此可利用荧光显微镜对重组慢病毒的感染效率以及外源基因在宿主细胞内的表达和定位情况进行监测。本研究筛选到的BHK-21-EGFP-SBV-N 细胞可自发绿色点状荧光信号，但关于荧光信号在胞浆内呈现点状分布的原因尚有待于进一步研究。本研究建立的BHK-21-EGFP-SBV-N 细胞系能够与SBV 抗体阳性的牛、羊血清R1 和R4 发生反应，表明该细胞系在SBV 的血清抗体检测方面具有一定的应用潜力。但由于缺乏大量的SBV 抗体阳性血清以及辛波血清群相关病毒的阳性血清对该细胞系进行进一步的验证，目前尚不清楚该细胞系在检测SBV 血清抗体时的特异性情况。

本研究建立了稳定表达SBV-N 蛋白的BHK-21细胞系，为SBV 血清抗体的检测提供了备用材料。

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