猪流行性腹泻病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立

曹贝贝，韩 丽，于朋飞，兰培英，程慧芳，宋 月，胡 慧

(1.河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450002；2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由PED 病毒(PEDV)引起的一种急性高度接触性肠道传染病。该病以猪水样腹泻、呕吐和脱水为典型特征，各种年龄的猪和不同品种的猪群均易感，但对哺乳仔猪的危害最为严重，1 周龄以内的哺乳仔猪发病后2 d～4 d 死亡，致死率高达90 %以上，给养猪业造成了严重的经济损失[1-2]。

PEDV 属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，为不分节段的线性单股正链RNA 病毒[3]。PEDV 基因组靠近3' 端5 kb 区域内含有5 个主要的开放阅读框(ORF)，编码典型的冠状病毒结构蛋白：核蛋白(Neucleocapsid，N)、膜糖蛋白(Membrane protein，M)、小膜蛋白(Small membrane protein，sM)和刺突糖蛋白(Spike protein，S)；以及位于sM 蛋白和S 蛋白之间的ORF3，编码未知功能的多肽性片段[4-6]。本实验根据GenBank 登录的PEDV 的ZKHFQ 株N基因序列，通过序列分析获得其高度保守的特异性序列，并根据该特异性保守序列设计了一对特异性引物。在此基础上建立了PEDV SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 检测方法，并对该方法进行了评价分析，为兽医临床的诊断和防制提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 病毒株及临床样品 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒II 型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病毒(PRV)均由本实验室保存。PEDV 的临床样品来自河南各地市及其周边地市养殖场的7 日龄以内乳猪的肠道内容物。

1.2 主要试剂 pMD18-T 载体、反转录试剂盒、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶、PCR 相关试剂、DNA Marker、DNA 凝胶回收试剂盒及SYBR Premix Ex Taq I 聚合酶均购自TaKaRa 公司；TRIzol 试剂购自Invitrogen 公司。

1.3 引物的设计及合成 应用Primer Premier 5.0 基因分析软件，参照GenBank 中登录的ZKHFQ 株PEDV N 基因序列设计一对引物5'-CAACAGCAGA AGCCCAAAC-3'/5'-GCTCACGAACAGCCACATT-3'，扩增PEDV N 基因部分片段(298 bp)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 重组质粒标准品的制备 按照TRIzol 总RNA提取试剂盒说明书方法提取RNA，参照Thermo 反转录试剂盒说明书进行反转录，将所得cDNA 进行常规PCR 扩增，PCR 产物纯化回收后与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序正确的阳性质粒作为DNA 标准品，用分光光度仪测定浓度后进行10 倍系列稀释，用于构建标准曲线。并根据标准质粒的浓度进行分析，计算质粒拷贝数。

1.5 荧光定量RT-PCR方法的优化 采用SYBR Premix Ex Taq 推荐的反应体系，以出现最高荧光值、出现最小的样本阈值循环数(Ct 值)以及在融解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，对退火温度、循环条件和循环次数等进行优化。

1.6 标准曲线的绘制 将计算出拷贝数的质粒做10 倍梯度稀释，选取8 个适宜的稀释度作为标准阳性模板进行RT-PCR 扩增反应，每个稀释度设3 个平行试验。对扩增结果进行分析，绘制标准曲线。

1.7 特异性试验 采用建立的扩增方法对TGEV、PPV、PCV2、PRRSV、PRV 基因进行扩增，并选取PEDV 阳性质粒作阳性对照，灭菌水作阴性对照，检验所建立方法的特异性。

1.8 敏感性试验 分别以5.7×105拷贝/μL～5.7×101拷贝/μL 的质粒标准品作为模板，进行荧光定量RT-PCR 扩增，确定能得出阳性结果的最低稀释度的拷贝数，同时用常规PCR 进行检测，比较两种方法的敏感性，同时设阴性对照。

1.9 重复性试验 采用建立的阳性标准质粒为模板，选取4 个稀释度，分别在同等条件下进行扩增，每个稀释度做4 个平行试验，计算变异系数；同时，将上述所用样品保存，每周检查1 次，连续检测2 周，计算不同批次间变异系数。

1.10 临床样品检测 对来自河南省及其周边地区的26 份疑似PED 病猪的小肠内容物按照实验室常规方法进行处理后，分别采用建立的荧光定量RT-PCR 方法和常规PCR 方法进行检测，比较两种方法的阳性检出率和符合率，并用统计学方法进行结果分析。

2 结果

2.1 阳性标准品的制备 利用设计的引物进行PCR扩增，经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，从肠道内容物中扩增出约300 bp 的片段(图1)。对阳性重组质粒进行序列测定，BLAST 比对结果显示其与参考序列的同源性为100 %，表明PEDV N 基因片段的重组质粒构建正确。经核酸蛋白分析仪测定计算，质粒浓度为187 ng/μL，即5.7×1010拷贝/μL。

图1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 Amplification of PEDV N gene by RT-PCR products

2.2 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立及反应条件的优化 通过反应条件的优化，20 μL 反应体系为：上下游引物各0.5 μL，质粒模板1 μL，SYBR Premix Ex TaqⅠ10 μL，ddH2O 8 μL，扩增参数为94 ℃5 min；95 ℃10 s、58 ℃10 s、72 ℃30 s，35 个循环。PEDV 荧光定量RT-PCR 扩增标准曲线如图2，溶解温度为85.79 ℃，标准差为0.0603，变异系数为0.000703。

选取浓度为5.7×108拷贝/μL～5.7×101拷贝/μL的质粒作为标准品，按照优化的条件进行荧光定量RT-PCR 扩增，得到的标准曲线如图2，斜率为-3.1899，截距为34.23，相关系数R2为0.99。结果显示其具有良好的线性关系。

图2 PEDV 荧光定量PCR 扩增标准曲线Fig.2 Standard curve of the real-time PCR for PEDV

2.3 特异性试验 以建立的荧光定量RT-PCR 分别对TGEV、PPV、PCV2、PRRSV 及PRV 等阳性模板进行检测。扩增结果显示，只有PEDV 扩增为阳性，其它均无特异性扩增(图3)，表明该方法具有较强的特异性。

2.4 敏感性试验 以10 倍倍比稀释的质粒标准品(5.7×105拷贝/μL～5.7×101拷贝/μL)作为模板，进行RT-PCR 和常规PCR 扩增。扩增结果显示RTPCR 的最低检测量为5.7×101拷贝/μL，常规PCR的最低检测量为5.7×102拷贝/μL(图4)，RT-PCR的敏感性是常规PCR 的10 倍，表明本实验建立的RT-PCR 方法具有较高的敏感性。

图3 PEDV 荧光定量RT-PCR 扩增特异性试验Fig.3 Specificity test dynamic curve of real-time RT-PCR

图4 荧光定量RT-PCR(A)与常规PCR(B)敏感性试验Fig.4 Sensitivity tests of real-time RT-PCR(A)and traditional PCR(B)

2.5 重复性试验 选取模板浓度分别为5.7×105拷贝/μL～5.7×102拷贝/μL 的重组质粒为样本，利用建立的荧光定量RT-PCR 方法分别重复扩增4 次，结果表明组内组间变异系数均小于1 %(表1)，表明该荧光定量RT-PCR 检测方法具有较高的可重复性。

表1 荧光定量RT-PCR 的重复性试验结果Table 1 Reproducibility test of intra-and inter-assay for the real-time RT-PCR

2.6 临床样品检测结果 对26 份疑似PED 的病料样品进行检测，荧光定量RT-PCR 和常规PCR 检测双阳性病料样品11 份，双阴性病料样品9 份，荧光定量RT-PCR 法检测出单阳性病料样品6 份。二者的符合率为82.76%，RT-PCR 方法的阳性检出率比常规PCR 方法高23.07 %。用统计学的方法进行分析，采取配对样品t 检验，得到2 种方法的p 值为0.01，具有差异显著，表明所建立的荧光定量RT-PCR 检测方法敏感性高于常规PCR。

3 讨论

PEDV 的N 基因相对保守，基因突变率较低，突变选择定向性差，不太适合用于病毒株间的精细遗传进化分析，但N 基因因这些特点更适合用于PEDV 的检测。

目前针对PED 的实验室诊断方法，大致可以分3 类，即病原学检测、对病毒的抗原或抗体检测和病毒RNA 的检测。传统的病原学检测主要是在电镜下观察病毒粒子，这种方法不但耗时，而且不能准确诊断病因。崔现兰等利用免疫学方法检测抗体可以了解病毒感染及疾病的发生、发展过程，但抗体只在病毒感后一定时期才出现[7]，因此，抗体检测作为快速检测PEDV 的方法受到限制。针对PEDV RNA 的检测方法很多，其中荧光定量PCR 技术应用更广泛，其以特异性强，灵敏度高，重复性好、定量准确等优点成为分子生物检测技术中的重要检测方法。

本实验构建了PEDV N 基因片段的标准质粒，基于SYBR Green I 建立了定量检测PEDV 的荧光定量RT-PCR 方法。研究数据显示，所建立的荧光定量RT-PCR 方法的熔解曲线产物峰单一整齐，无引物二聚体峰，熔解温度为85.79 ℃，与其他猪源病毒无交叉反应；质粒浓度在5.7×101拷贝/μL～5.7×108拷贝/μL 范围内的标准曲线的相关系数为0.99，显示出良好的线性关系；组间与组内试验的变异系数均小于1 %。表明建立的方法具有很好的特异性、重复性及灵敏性。用建立的荧光定量RT-PCR 对26份疑似PEDV 感染的临床病料样品进行了检测，结果有17 份呈阳性，而常规PCR 只检出11 份为阳性。而常规PCR 检测结果为阳性时，荧光定量RT-PCR 检测结果均为阳性，由此表明，荧光定量RT-PCR 比常规PCR 检测不仅灵敏度高，而且可以进行定量分析。荧光定量RT-PCR 方法对临床样品中PEDV 的检出率明显高于常规PCR，并且符合率为76.92 %。

综合分析表明，该方法具有良好的特异性、敏感性及可重复性，不但可以应用于PEDV 的流行性病学调查，也为PEDV 的定量检测及其早期感染的快速诊断奠定了基础。

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