猪伪狂犬病病毒HNX株在免疫猪群中水平传播能力的研究

张明辉，库旭钢，凌云志，杨子靖，何启盖*

(1.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 动物医学学院，湖北 武汉 430070)

猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)可以引起不同年龄段的猪发病，主要表现为发热、神经症状和繁殖障碍[1]。PRV 主要通过水平传播，也可以垂直传播[2]。在合适的环境中，病毒也可以气溶胶的形式传播[3]。

在一些欧洲国家，严格的净化措施已经彻底根除了PRV 在家畜中的传播[4]。2012 年以来，中国华北和华东地区大面积流行猪伪狂犬病(PR)，发病率高达50 %～94.2 %，死亡率达10 %～30 %[5-6]。目前，有效的预防PR 的方法仍是免疫接种，gE 缺失基因工程苗的应用有利于PR 的净化工作。但新变异病毒株的出现，使现有疫苗的保护作用更加有限，即使按程序免疫的猪场仍然暴发PR[7]。

评价一种病毒是否发生重要变异，水平传播能力是一项重要的判定指标。本研究为验证PRV HNX株在猪群中的水平传播能力，通过对不同的疫苗保护力指标进行检测，评估Bartha-K61 株疫苗阻止PRV 水平传播的能力，为新型疫苗研制提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞、疫苗及实验动物 PRV HNX株由本实验室分离鉴定；PRV 鄂A 株(Ea)、闽A 株(Fa)、IBRS-2 细胞及重组标准质粒pMD-gD 均由本实验室保存；Bartha-K61 株疫苗(gE 缺失基因工程苗)购自德国勃林格殷格翰公司；16 头80 日龄PRV阴性猪购自湖北省红安县农户。

1.2 主要试剂 ELISA 试剂盒购自IDEXX 公司；细胞因子检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR 相关试剂购自TaKaRa 公司；Probe Master Mix 酶购自Roche 公司；荧光定量PCR 探针及引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 实验动物分组及免疫 16 头PRV 阴性猪分为A、B 两组。A 组6 头，每头肌肉注射Bartha-K61株疫苗1 头份；B 组10 头，为未免疫组。免疫前、免疫后7 d、14 d、21 d 前腔静脉采血，分离血清，-80 ℃保存备用。

1.4 抗体及细胞因子检测 采用ELISA 试剂盒检测血清样品中抗gB 和gE 蛋白的抗体水平，S/N 值小于0.6 结果判为阳性，S/N 值大于0.7 为阴性；采用细胞因子检测试剂盒检测细胞因子α、β、γ 干扰素(IFNs)水平，并通过血清交叉保护中和试验综合评价疫苗保护力[8]。将200 TCID50的病毒(HNX株、Ea 株、Fa 株)与稀释的血清互作，加入细胞悬液，设立病毒对照和正常IBRS-2 细胞对照，持续观察3 d，以保护50 %细胞不出现病变的血清最高稀释倍数表示中和效价。

1.5 同居感染试验 根据抗体及细胞因子检测结果，在免疫后21 d，采用PRV HNX 株人工感染B组中抗gB 蛋白抗体水平较低的4 头猪，感染剂量为2 mL 107TCID50/只，颈部肌肉注射，并将人工感染的4 头猪分配2 头到A 组、2 头留在B 组，作为传染源以水平感染其它猪只。此时的饲养密度为1.31 m2/头。人工感染后每天观察猪只临床症状并采集鼻、粪拭子，监测直肠温度，持续14 d；每隔7 d采血，持续4 周。

1.6 排毒监测 采集的鼻、粪拭子经PBS 震荡重悬，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，根据DNA提取试剂盒提取鼻、粪拭子DNA，采用gD 基因Taq Man 荧光定量PCR 方法[9]检测排毒情况，引物和探针序列为：PRV-gD-F(5'-CATCCTCACCGACTT CAT-3')/PRV-gD-R(5'-TACCAGTAGTTCACCACC-3')和PRV-gD-probe(5'-CAAGAGTGCCCGTTCGCC-3')。反应条件为：50 ℃2 min，95 ℃10 min；95 ℃15 s、56 ℃20 s、60 ℃50 s，40 个循环；72 ℃10 min。

标准质粒的初始浓度为649.3 ng/μL，换算结果为1.52×1011拷贝/μL。将标准质粒10 倍梯度稀释至1.52×1010拷贝/μL～1.52×101拷贝/μL，利用常规PCR 方法验证荧光定量PCR 的敏感性。常规PCR 目的基因为gD 基因，扩增大小为217 bp，引物为：PRV-gD-F(5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3')/PRV-gD-R(5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3')。反应条件为：94 ℃3 min；94 ℃40 s、57 ℃40 s、72 ℃45 s，35 个循环；72 ℃10 min。

2 结果

2.1 疫苗免疫效果 以Bartha-K61 株疫苗免疫A组实验猪，ELISA 检测结果显示A 组的gE 抗体均呈阴性，B 组gB 和gE 抗体均呈阴性。免疫后7 d，A 组3 头实验猪呈gB 抗体阳性；免疫14 d 后，A组全部为gB 抗体阳性(图1)。结果表明Bartha-K61株活疫苗免疫后能够快速诱导机体产生免疫反应。

细胞因子检测结果显示，A、B 两组IFNs 差异不显著，而且未免疫的B 组实验猪产生的IFNs 水平也在逐渐升高(图2)。

免疫Bartha-K61 株活疫苗21 d 的A 组实验猪血清中和PRV HNX 株中和效价最高达1∶5.62，只有5头实验猪产生有效中和Ea 株和Fa 株的中和抗体(表1)。

图1 免疫后gB 抗体水平Fig.1 Seroconversion for gB antibody after vaccination

图2 免疫后IFNs 水平检测结果Fig.2 The detection for IFNs at different times after vaccination

表1 免疫后实验猪血清中和抗体水平Table 1 Neutralization antibodies in pigs post vaccination

2.2 同居感染试验结果 采用PRV HNX 株人工感染B 组4 头猪后平均分配至A 组和B 组。被动感染3 d 后，部分免疫猪和未免疫猪出现临床症状，表现为打喷嚏、咳嗽、采食不积极、扎堆，但无神经症状。被动感染后7 d 免疫猪和未免疫猪体温有明显的升高(图3)。感染后14 d，所有实验猪临床症状消失，无死亡。抗体检测结果显示，被动感染7 d 后，免疫组实验猪均为gE 抗体阴性；14 d 后，免疫组3 头猪gE 抗体转阳；21 d 后，免疫组6 头猪全部gE 抗体转阳。表明Bartha-K61 株疫苗无法阻止HNX 株水平传播感染。

2.3 排毒监测 同时收集实验猪的鼻、粪拭子，采用荧光定量PCR 方法监测实验猪2 周内的排毒情况。结果显示，人工感染后实验猪鼻拭子中能够检测到病原，粪拭子中未检测出病原。同时使用常规PCR 方法检测荧光定量PCR 所用标准质粒，结果显示常规PCR 方法只能检测到103拷贝/μL 的标准质粒，因此荧光定量PCR 检测鼻拭子排毒的结果以103为起始值表示更为准确。检测结果显示免疫猪和未免疫猪受到感染后持续排毒，持续一周(图4)。

图3 同居感染后实验猪体温变化Fig.3 Rectal temperature of pigs after cohabitation

图4 同居感染后实验猪排毒检测结果Fig.4 The detection of virus excretion in pigs after cohabitation

3 讨论

IFNs 在抗PRV 感染中具有重要的作用[10]。疫苗免疫后，免疫猪产生的IFNs 差异不显著，而且未免疫猪产生的IFNs 水平也在逐渐升高，因此IFNs 指标在本研究中无法有效地评价疫苗保护力，IFNs 量化评估指标有待进一步研究。中和抗体在体液免疫中发挥重要作用，本研究实验结果显示免疫猪gB抗体水平很高，但中和抗体水平却较低，甚至没有。这与其他研究结果相同[11]。中和抗体水平低，导致群体免疫保护率低，最终未能阻止PRV HNX株的水平传播。即使Bartha-K61 株活疫苗在一定程度减慢了gE 抗体转阳速度，但最终仍未能阻止gE抗体转阳，未能阻止野毒感染。

荧光定量PCR 方法能够量化直观地比较不同样品的载毒量[12]，本实验通过Taq Man 荧光定量PCR方法检测鼻拭子载毒量进而反应鼻排毒量。本实验中饲养密度为1.31 m2/头，人工感染猪在2 周内持续排毒，免疫猪和未免疫猪受到被动感染7 d 后开始持续排毒。预试验中发现滴鼻感染极易造成实验猪急性死亡，因此本研究采用肌肉注射途径，使人工感染猪成为有效的传染源。被动感染的实验猪均表现敏感，并且最终均呈野毒感染状态，表明PRV HNX 株具有很强的水平传播能力。这也暗示猪场育肥阶段的猪有必要加强免疫，不然一旦发生野毒感染，即使不造成死亡也会存在散毒的风险，不利于猪伪狂犬病的控制与净化。

本研究从免疫学指标和临床指标两大方面评价Bartha-K61 株活疫苗的保护力。从免疫学指标来看，疫苗诱导的血清中和抗体水平较低，不能够提供完全的保护力以抵抗新变异病毒株的感染。因此，有必要研制新型疫苗提升保护力。本研究为客观综合评价猪伪狂犬病疫苗的保护力提供参考。

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