整合埃博拉病毒囊膜蛋白的伪病毒的构建

王玉杰，王 斌，时 静，胡 丹，于 群，郑永辉

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室-美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室，黑龙江哈尔滨 150001)

埃博拉出血热自1976 年在非洲扎伊尔首次爆发以来，已经在非洲引起多次暴发。其中以2014 年在非洲中部国家发生最为严重，共造成10 000 多人死亡，引起各国科学家的广泛关注[1]。

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)属于丝状病毒科，其基因组为单股负链RNA，该病毒可以引起高度接触性出血热症状，致死率可达90 %，为病死率最高的传染病病原之一[2-3]。EBOV 共分为5 个亚型，即扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、本迪步焦型和科特迪瓦型[4-5]。病毒的基因组编码7 种蛋白，依次为NP、VP35、VP40、GP、VP30、VP24 和L。其中GP 在翻译后水解为GP1、GP2 两种形式[6-8]。病毒通过其GP 与靶细胞表面的受体结合，而启动感染过程[9]。目前对EBOV 病仍没有有效的疫苗防制方法，由于该病毒的活毒操作需要在生物安全4 级实验室进行，因此有必要建立一个能够替代活病毒操作的、安全方便的病毒研究平台。

伪病毒是人为构建的一种外表面由靶病毒的囊膜蛋白作为外壳，而内部骨架却是由另一种病毒的核酸及蛋白组成的病毒颗粒[10-11]。这种病毒表面缺少自身囊膜蛋白，基因组上也没有编码囊膜蛋白的基因，因此只能进行单轮感染，属于复制缺陷型病毒。由于表面包裹的是靶病毒的囊膜，因此可以模拟真病毒研究病毒的侵入机制，尤其适用于在常规条件下对高度危险性病原的研究。本研究通过将含有GP 基因的重组质粒与囊膜蛋白缺失、表达绿色荧光蛋白(GFP)的人免疫缺陷病病毒1 型(HIV-1)基因组的重组质粒共转染293T 细胞，构建了具有一轮感染力的伪型EBOV，为后续研究EBOV 的感染机制及中和抗体的筛选提供了一个良好的平台。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 表达GFP 蛋白及表面囊膜蛋白基因缺失的HIV-1 基因组的重组质粒pNL-△Env-GFP、293T、Vero、人宫颈癌细胞(Hela)、人骨肉瘤细胞(Ghost)细胞系均由本实验室保存；与Flag 标签融合表达的EBOV 囊膜蛋白GP 基因的重组质粒pcDNA-EboVGP 由密苏里大学分子微生物与免疫学系Liu Shan-lu 教授馈赠；聚乙烯亚胺(PEI)购自Polysciences 公司；鼠源抗Flag 标签抗体和兔源抗GP 的单克隆抗体(MAb)购自Sino Biological 公司；HRP 标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG(IgG-HRP)购自Jackson 公司；ECL 底物显色液购自Thermo 公司；

1.2 EBOV GP蛋白的表达鉴定 将0.5×106个293T细胞铺于6 孔板，37 ℃5 % CO2中培养24 h 后，将2 μg pcDNA-EboVGP 与6 μL PEI 转染细胞，4 h更换含有10 %胎牛血清、1 %青霉素及1 %链霉素的培养液。以质粒pcDNA3.1 为空白对照，转染后48 h 收集细胞，经PBS 洗涤，RIPA 冰浴裂解10 min。利用SDS-PAGE 检测后，转印NC 膜，分别以鼠源Flag 抗体和兔源Ebov-GP 抗体为一抗，分别以羊抗鼠和羊抗兔IgG-HRP 为二抗，ECL 孵育，胶片曝光，进行western blot 鉴定。

1.3 伪型EBOV的组装及检测 将3.5×106个293T细胞铺于100 mm 的细胞培皿中，将10 μg pcDNAEboVGP、10 μg pNL-△Env-GFP 与30 μL PEI 按上述转染方法进行共转染。同时以转染10 μg pNL-△Env-GFP 与20 μL PEI 为对照。48 h 后收集细胞培养上清，3 000 r/min 低速离心10 min 后25 000 r/min 超速离心2 h，弃上清，90 μL RIPA 重悬管底沉淀，按照上述方法进行western blot 检测，并以HIV 基质蛋白(p24)及β-actin 蛋白作为检测内参。

1.4 伪型EBOV的感染 采用制备的伪病毒粒子分别感染单层的Vero、293T、Ghost、Hela 细胞。于感染后48 h 通过荧光显微镜观察报告基因GFP的表达，同时收集病毒感染后的细胞，流式细胞仪分析假病毒感染细胞的情况，计算GFP 阳性细胞比率(GFP 阳性细胞比例间接反映了伪型病毒粒子对细胞的感染水平)，以确定伪病毒在各种细胞中的感染力。

2 结果

2.1 EBOV GP蛋白表达的鉴定 将重组质粒pcDNA-EboVGP 和pcDNA3.1 空白对照质粒分别转染293T 细胞后，48 h 后收集细胞进行蛋白裂解。Western blot 试验显示，利用鼠源Flag 标签抗体及兔源抗EBOV GP 蛋白特异性抗体均能够检测到GP 蛋白的表达，而空白对照组未检测到蛋白表达(图1)。表明GP 蛋白可以正确的表达。

2.2 伪型EBOV的组装 将重组质粒pcDNAEboVGP 和pNL-△Env-GFP 重组质粒共转染293T 细胞，48 h 之后收集转染细胞上清。Western blot 结果显示，pNL-△Env-GFP 质粒转染细胞以后，HIV 基质蛋白p24 能够表达，表明病毒的基因组能够提供伪型病毒包装所需的相关组分。对超速离心纯化的伪型病毒粒子进一步进行western blot 检测，结果表明HIV p24 蛋白与GP 蛋白能够同时被检测到，而阴性对照组仅能够检测到p24 蛋白(图2)，表明GP蛋白与HIV 基因组及相关蛋白进行了有效组装。

图1 EBOV GP 蛋白在293T 细胞中的表达Fig.1 The expression of the GP protein in the 293T cells

图2 假病毒粒子组装的检测Fig.2 Detection of the package of GP-pseudotyped virus

2.3 伪型EBOV的感染试验 收集转染后含有伪病毒的上清液分别感染Ghost、Hela、Vero、293T细胞系，结果显示感染48 h 后在几种细胞系中均可检测到报告基因GFP 的表达(图3A)；为确定病毒对不同细胞的感染效率差异，收集感染后的细胞，通过流式细胞仪进行检测，计算GFP 阳性细胞比率。结果表明，构建的伪病毒能够感染6 种细胞，其中对Ghost、Vero 的感染效率较高，但对Hela、293T 细胞感染效率较低(图3B)，表明Ghost、Vero两种细胞更适合于伪型病毒的特性研究。

3 讨论

图3 假病毒对不同细胞的感染Fig.3 The infection of the pseudovirus in different cells

生物安全是公共安全领域优先发展领域中的重要内容之一，而EBOV 具有极强的接触传染性，必须在生物安全4 级实验室完成对该病毒的实验操作，为研究带来了诸多不便。由于伪型病毒是复制缺陷型，只具有一轮感染力，因此为病毒的研究提供了一种安全、有效的技术手段。近来，伪型病毒的构建和应用为研究高致病性病毒的囊膜蛋白的结构和功能提供了良好的平台。目前应用的假病毒核心主要是以HIV-1 为基础的慢病毒和以VSV、MMLV 病毒为基础的逆转录病毒[12]。本研究是通过构建表达EBOV 囊膜蛋白基因的重组质粒，与囊膜蛋白缺失、表达有绿色荧光GFP 蛋白的HIV-1 基因组的重组质粒共转染293T 细胞，结果表明，两种质粒所携带蛋白的基因均可以在293T 细胞中正确表达，并且表达后可以进行组装获得伪病毒粒子，以此模拟活病毒进行细胞的感染试验，从而可以更加方便安全地研究EBOV 的病原学、致病机理及免疫学等相关工作，为攻克EBOV 准备理论基础。

目前携带有荧光素酶或者GFP 报告基因的假病毒具有很广泛的应用，如SARS-CoV[13]、H5N1 高致病性禽流感病毒、丙型肝炎病毒等均有过报道，本研究中利用带有GFP 作为报告基因的HIV 慢病毒系统，获得了具有感染力的EBOV GP 蛋白伪型病毒。GP 蛋白是诱导EBOV 中和抗体的关键蛋白，与病毒的入侵、细胞毒性等均起着关键作用，本研究构建的伪型病毒为病毒特异性中和抗体的筛选及蛋白功能的研究奠定了基础。

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