G2系和G5系鸡感染马立克氏病毒早期细胞因子转录水平的变化

蔡文博，吴少莲，彭蔚宇，王丽廷,3，陈洪岩，韩凌霞*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学团队，黑龙江哈尔滨 150001；2.常州市金坛区动物疫病预防控制中心，江苏常州 213200；3.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

马立克氏病(Marek's disease，MD)是由马立克氏病毒(MDV)引起的一种鸡恶性淋巴组织增生性疾病。不同主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)B 单倍型鸡对感染MD 有遗传学抗性和免疫学差异[1-2]。

G2 系和G5 系鸡群是国家禽类实验动物种子中心培育、保存的两个无特定病原体(SPF)鸡品系，分别具有B15 和B5 单倍型特征[1,3]。MD 疫苗对B5 和B21 单倍型鸡的保护力不同，对B15 的保护力强于B2 和B13[1]，但MDV 对B15 和B5 单倍型鸡的致病性及引起的免疫反应差异还未见详细报道。本实验室前期研究中曾揭示14 日龄～35 日龄健康G2 和G5 系鸡肺淋巴细胞、脾脏和外周血淋巴细胞(PBL)中IFN-γ、IL-18、IL-4 和IL-104 种细胞因子的转录水平存在差异[4]。Th1 型和Th2 型细胞因子在包括G2 和G5 系在内的70 日龄MHC B 单倍型鸡的初级免疫器官中呈高水平转录，并且相互制衡，例如胸腺中IFN-γ 和IL-4 相互平衡，法氏囊中为IL-18 与IL-10[5]。B19 和B21 单倍型鸡腹腔接种超强毒MDV(vvMDV)后第4 d、7 d、10 d、13 d，IFN-γ、IL-18、IL-4 和IL-10 的转录水平表现出不同的动态趋势[6]。机体天然免疫应答在病毒感染的第一时刻发挥作用，并影响病程的转归。本实验模拟自然感染途径，对G2 和G5 系SPF 鸡接种MDV，研究感染立即早期肺淋巴细胞、脾脏和PBL 中病毒致瘤基因meq 及IFN-γ、IL-18、IL-4 和IL-10 的转录水平，为揭示MD 的天然免疫机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株、重组质粒及实验动物 vvMDV Md5株、含有MDV meq 基因的重组质粒pMD-M 由哈尔滨兽医研究所禽病室刘长军副研究员馈赠。分别含有IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-18 和28S rRNA 基因的重组质粒p-IFN-γ、p-IL-4、p-IL-10、p-IL-18、p-28s rRNA 由本实验室制备保存[5]。白来航系列G2 系和G5 系SPF 鸡由本研究所实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 鸡淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；RNA Isoplus、M-MLV反转录酶、RNA 酶抑制剂、dNTP Mixture(10 mmol/L)、Premix Ex TaqTM等购自TaKaRa 公司；质粒小量提取试剂盒购自Omega 公司。

1.3 引物、探针的合成及标准曲线的构建 分别以meq、鸡IFN-γ、IL-4、IL-10 和IL-18 为检测靶基因，以28S rRNA 为内参基因，建立双重荧光定量RT-PCR(dqRT-PCR)方法。meq、IFN-γ、IL-18、IL-4、IL-10 和28S rRNA 的引物及荧光素标记探针参照文献设计合成[7-8]，除28S rRNA 探针的5' 端用荧光素HEX 标记外，其余均采用FAM，所有探针的3' 端淬灭基团均为BHQ1。引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。按照之前建立的方法构建标准曲线[5]。使用Bio/Rad IQ5 定量PCR仪进行扩增。

1.4 动物接种实验 将24 羽G2 系和24 羽G5 系14 日龄SPF 雏鸡，分为感染组和对照组，不分雌雄，各12 羽。感染组滴鼻接种MDV Md5 株细胞毒，每羽2 000 pfu(0.2 mL)，对照组接种等量无菌PBS。接种后4 h、24 h、48 h 和96 h 感染组和对照组分别各取3 只，采集翅静脉肝素钠抗凝血、肺脏(从喉头至两个完整肺脏)和脾脏。

1.5 病毒及细胞因子mRNA定量检测 按照鸡淋巴细胞分离液说明书分离PBL；将肺脏置于预冷的PBS 中洗涤，剪碎，采用注射器尾部在200 目铜网上研磨，分散成单细胞，按照分离PBL 的方法分离淋巴细胞；将脾脏剪碎，采用研磨棒充分研磨。分别提取各组织总RNA，经反转录得到cDNA，按照之前建立的方法[5]，利用dqRT-PCR 检测MDV meq、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-18 的mRNA 相对含量。利用SAS 软件中的LSD 法进行数据分析。

2 结果

2.1 MDV转录水平的比较 G2 和G5 系鸡群感染MDV 后96 h，在肺淋巴细胞和脾脏中检测到MDV meq 的mRNA，而且肺淋巴细胞中的含量高于脾脏。G2 系鸡群肺淋巴细胞中的病毒mRNA 含量高于G5，脾脏中低于G5，但均无统计学意义(图1)。在PBL 中始终未检测到。对照组未检出。

2.2 IFN-γ 转录水平的比较 感染MDV 后鸡肺淋巴细胞中IFN-γ 转录水平比对照组持续明显升高，96 h G2 系升高5 170 倍，G5 系升高3 330 倍(图2A)，脾脏中始终高于对照组(图2B)，PBL 中一直处于较低水平(图2C)。

2.3 IL-18转录水平的比较 感染MDV 后，鸡肺淋巴细胞(图3A)和PBL 中(图3C)IL-18 转录水平与对照组相当，G2 系感染组脾脏中IL-18 转录水平始终高于G5(图3B)。

图1 病毒转录水平的动态变化Fig.1 MDV transcript levels

图2 IFN-γ 转录水平的动态变化Fig.2 IFN-γ transcript levels

图3 IL-18 转录水平的动态变化Fig.3 IL-18 transcript levels

2.4 IL-4转录水平的比较 感染MDV 后96 h G2和G5 系肺淋巴细胞及脾脏中IL-4 转录水平急剧上升，均明显高于对照组(图4)。

图4 IL-4 转录水平的动态变化Fig.4 IL-4 transcript levels

2.5 IL-10转录水平的比较 感染96 h 后肺淋巴细胞中IL-10 转录水平大幅升高，G2 高于G5(图5A)，G2 系和G5 系脾脏中表现出不同的动态变化(图5B)，PBL 中IL-10 转录水平始终低于对照组(图5C)。

图5 IL-10 转录水平的动态变化Fig.5 IL-10 transcript levels

3 讨论

呼吸道粘膜系统是MDV 侵入鸡的重要途径，自然环境下鸡通过吸入吸附有病毒的粉尘或尘埃而发生感染，病毒感染过程的立即早期阶段，机体的细胞免疫应答水平和类型是影响病程转归的重要因素。前期研究结果表明，MHC B 单倍型鸡不同组织器官中的多种细胞因子转录水平受日龄、病程以及品系的影响[6]。

给鸡利用吹入方式感染MDV 的粉尘后，易感鸡和抗性鸡的肺脏分别于感染后2 d 和3 d 检测到病毒基因的转录，而脾脏是在3 d 和4 d[9]。本实验为模拟自然感染途径，在参考了Davidson 和Borenshtain 用点眼和经口接种的方式基础上，选择了滴鼻感染[10]。结果在感染后96 h，在肺和脾脏中检测到病毒的转录，但G2 系肺中的病毒转录快于G5系，脾脏中低于G5 系，暗示病毒粒子在G2 系鸡可能较快适应并起始复制，但在之后与机体免疫系统的抗衡遭到较大阻力。

IFN-γ 被转录激活是感染病毒的典型特征。IFN-γ 通过位于iNOS 基因上游调控元件激活iNOS的转录，增加Mφ 中iNOS 的含量，催化NO 的产生，从而抑制MDV 的复制[2]。抗性鸡肺脏比易感鸡更早诱导IFN-γ[9]，其高水平转录可以更快地使MD从溶细胞感染进入潜伏期[11]。感染强毒株MDV 后，抗性鸡和易感鸡脾细胞中IFN-γ 转录升高程度无显著性差异[12]，而感染超强毒后，前者转录水平显著高于后者[13]。本实验感染vvMDV 后，G2 系和G5系肺淋巴细胞(48 h)和脾脏(96 h)中IFN-γ 转录水平升高，G2 系高于G5 系，与文献报道的结果一致[11]。Quere 等人发现，抗性鸡感染MDV 早期外周血中IFN-γ 的mRNA 含量少量增多，易感鸡无变化[14]。96 h 后G2 系攻毒组肺淋巴细胞、脾脏和PBL 中IFN-γ 转录水平均高于G5 系，可能说明G2 系对MD 的抵抗能力相对强于G5 系。

IFN-γ 与IL-18 等促炎细胞因子存在相互促进作用[9]。本实验中G2 系感染组肺和脾脏中IL-18 转录水平均高于G5，可能与IFN-γ 的分泌有关。文献报道感染强毒株JM-16 后，易感鸡和抗性鸡脾细胞中IL-18 转录水平相当[12]。

感染96 h 后两品系鸡肺淋巴细胞和脾脏中IL-4和IL-10 转录水平均升高，与文献报道其他品系鸡感染5 d 后脾脏中IL-4 和IL-10 转录水平上调以及96 h 后脾脏CD4+T 细胞和CD8+T 细胞中IL-10 转录水平上调的结果一致[12,15]。IL-4 和IL-10 转录水平上调是Th2 型免疫反应的标志[15]，通过阻止IFN-γ等Th1 型细胞因子的分泌抑制Th1 型免疫反应。

相信了解不同MHC 单倍型鸡感染MDV 后立即早期的细胞免疫应答变化，对阐明MD 感染的免疫遗传相关性具有重要的提示意义。G2 和G5 系鸡是根据MHC 单倍型在SPF 白来航鸡的基础上选育出来的，本研究结果提示G2 系对MDV 的抵抗能力强于G5 系，这两种品系鸡感染MDV 后可能主要启动以Th2 型为主的细胞免疫反应，为研究MDV 对不同MHC 单倍型鸡的致病性提供了实验依据。

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