副猪嗜血杆菌血清5型与4型菌株的差异表达蛋白分析

李 军，谢宇舟，彭 昊，禤雄标，潘 艳，杨 威，胡 帅，马春霞，许力干，陈泽祥*

(1.广西兽医研究所，广西南宁 530001；2.广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁 530001；3.广西兽药监察所，广西南宁 530001)

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，可以引起断奶仔猪纤维素性浆膜炎、脑膜炎和多发性关节炎，是当前导致断奶仔猪死亡的主要病原[1]。根据Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)方法，将HPS 分为1～15 个血清型，此外，还有约20 %的菌株未能定型。HPS 菌株血清型的差异导致其毒力各不相同，强毒力的血清1、5、10、12、13 和14 型可以在4 d 内导致猪死亡；而中毒力的血清2、4 和15 型主要引起纤维素性浆膜炎和多发性关节炎[2]。

由于HPS 血清型的多样性，目前对其致病的分子机制还缺乏了解，虽然HPS 血清4、5 和12 型的全基因组序列已经被解析[3-5]，但还需要结合蛋白质组学方法才能够进一步对HPS 进行系统研究。同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术可以对细胞器、细胞裂解液等复杂样本进行相对和绝对定量研究，具有高通量分离和鉴定蛋白质能力及较好的定量效果和较高的重复性，该技术已经在细菌学研究中用于鉴定差异表达蛋白[6]。

本研究利用iTRAQ 技术结合质谱分析，分析HPS 血清5 型与血清4 型菌株的蛋白质组差异，获得表达差异的蛋白，并根据蛋白质直系同源簇(Cluster of orthologous Groups of proteins，COGs)数据库将表达差异的蛋白按照功能进行分类，筛选出HPS 血清5 型和4 型表达差异蛋白，以期为HPS 的研究提供线索。

1 材料和方法

1.1 菌 株 HPS 血清5 型菌株gx041 和血清4 型菌株gx033 由本实验室2011 年分离自广西博白县濒死保育猪的肺细支气管[3,7]。

1.2 主要试剂和仪器 HPS 血清型1～15 的高免兔血清购自武汉科前动物生物制品有限责任公司；蛋白提取试剂RIPA 裂解液、丙酮、过硫酸铵、TEAB、SDS 等购自Bio-Rad 公司；iTRAQ®Reagent 8 Plex Chemistry 试剂盒、TEAB 等试剂购自ABI 公司。Triple TOF 5600 质谱仪购自AB Sciex 公司。

1.3 菌体蛋白提取时间的确定 将HPS gx041 和gx033 菌株分别接种于含0.05 % NAD 和5 %胎牛血清的TSA 培养基，37 ℃培养复苏后，复壮3 代，挑单一菌落接种TSB 培养基，37 ℃培养12 h 后，按培养基总体积的10 %接种于TSB 培养基，37 ℃摇床培养；每隔1 h 利用分光光度计测定培养基的OD600nm值，同时取样进行平板菌落计数。每个菌株重复3 次测定，绘制菌株的生长曲线，确定提取菌体蛋白的时间。

1.4 菌体蛋白的提取 HPS gx041 和gx033 菌株经37 ℃摇床培养31 h 后，4 ℃13 000 r/min 离心10 min收集菌体，PBS 洗涤3 次，收集沉淀。采用RIPA裂解液重新悬浮沉淀菌体，冰浴超声(9.9 s/间隔9.9 s，200 w)，4 ℃过夜裂解。4 ℃13 000 r/min 离心10 min 后取上清，6 倍体积含0.07 % DTT、10 %TCA 的丙酮溶液沉淀30 min；4 ℃13 000 r/min 离心20 min，弃上清；沉淀物经含0.07 % DTT 的丙酮溶液重新悬浮，4 ℃13 000 r/min 离心10 min，弃上清，重复2 次；裂解液复溶，4 ℃13 000 r/min离心10 min，上清即为待用的菌体蛋白。

1.5 蛋白质酶解和iTRAQ标记 每组蛋白样品取100 μg，按蛋白∶酶(20∶1)的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解4 h；重复1 次，37 ℃再酶解8 h。真空冻干肽段，加入含0.1 % SDS 的50 % TEAB 复溶。按iTRAQ®Reagent 8 Plex Chemistry 试剂盒的操作方法进行肽段的标记，iTRAQ 8 Plex 114 标记HPS 血清5 型gx041 菌株组，iTRAQ 8 Plex 115 标记HPS血清4 型gx033 菌株组。

1.6 标记肽段的SCX分离和质谱分析 加入8 倍体积的SCX A 液，调节pH 至3。清水清洗柱子，平衡，除盐，利用0.1 % FA 复溶，进行质谱检测。

1.7 蛋白质鉴定和定量 应用Mascot 软件进行蛋白质鉴定。依据蛋白质丰度水平，当差异达到2 倍以上，并且经统计检验其p<0.05 时，视为差异表达蛋白质。

1.8 生物信息学分析 根据COGs 数据库将差异表达的蛋白按照功能进行分类，筛选出HPS 血清5 型的差异表达蛋白，差异表达蛋白的注释参照HPS 血清12 型ZJ0906 株(CP005384.1)进行。

2 结果

2.1 HPS菌株生长曲线的绘制 HPS gx041 和gx033在TSB 培养基中接种5 h 后，培养基的OD600nm值开始上升，在培养31 h 时，OD600nm值达到峰值，以后随着时间延长，OD600nm值基本保持水平趋势(图1)。根据OD600nm值绘制的HPS 生长曲线与平板菌落计数的结果基本一致，因此，本实验以HPS 菌株培养31 h 作为提取菌体蛋白的时间。

图1 HPS 菌株的生长曲线Fig.1 Growth curve of HPS

2.2 iTRAQ标记的蛋白图谱整体分析 HPS 血清5型gx041 与血清4 型gx033 菌株的蛋白样品通过iTRAQ 标记后，经Triple TOF 5600 质谱仪分析显示，共获得45 540 张肽段谱图，含6 830 个肽段，其中6 783 个为特有肽段，分属于874 个蛋白，占HPS 基因组表达蛋白的39.9 %(874/2 189)。在这874 个蛋白中，有超过47.9 %(419/874)的蛋白肽段序列覆盖度大于50 %(图2A)。它们的分子量主要集中在10 ku～50 ku(图2B)。

图2 iTRAQ 鉴定到的蛋白总概图Fig.2 Over view of the iTRAQ quantitative proteomics analysis

2.3 表达差异蛋白分析 通过设定蛋白丰度水平的差异达到2 倍以上(p<0.05)，视为差异表达，经统计HPS 血清5 型菌株gx041 有99 个蛋白的表达发生变化，占检测蛋白总数的11.33 %(99/874)，表达上调的蛋白有86 个，表达下调的蛋白有13 个。根据COGs 数据库把表达差异的蛋白按照功能进行分类，可以分为能量产生和转化、离子转运、氨基酸转运和代谢、辅酶转运和代谢、糖转运和代谢、DNA 复制和损伤修复、RNA 加工和修饰、细胞外结构、细胞膜/壁形成、细胞运动性、转录后加工/分子伴侣、转录、翻译/核糖体结构、功能未知14 类(表1)，其中转铁结合蛋白1(Tbp1)、热休克蛋白(GrpE)等24 个蛋白的表达变化在3 倍以上(表2)，占表达差异蛋白总数的24.24 %(24/99)。

表1 HPS 血清5 型菌株表达差异蛋白功能分类Table 1 Biological function classification of differentially expressed proteins of HPS serovar 5

3 讨论

研究表明，猪鼻内接种强毒力HPS 菌株12 h后，即可在鼻窦和气管分离出菌株，强毒菌株在鼻窦和气管的定植，可以导致气管纤毛活动的显著降低和纤毛上皮细胞的损伤，并引发肺部的感染[8-9]。本实验结果显示HPS 血清5 型菌株的大黏附素蛋白(Large adhesin)表达为血清4 型菌株的2.1 倍，表明该蛋白可能与菌株侵入机体，定植黏膜表面的能力密切相关，是一个值得研究的蛋白。

表2 HPS 血清5 型菌株表达差异在3 倍以上的蛋白Table 2 Proteins with expressed more than 3-fold of HPS serovar 5

在HPS 血清5 型菌株检测到的高丰度表达的蛋白中，50S 核糖体蛋白亚基L2、L17、L19、L22、L28、L33 以及30S 核糖体蛋白亚基S3、S6、S7、S9、S10、S11、S12、S16、S18 的表达上调2.45～3.28 倍，核糖体蛋白是组成核糖体的主要成分，在细胞内蛋白的生物合成中发挥重要作用，它们表达的上调可能会造成细菌生长相对加快，有助于菌株的迅速定植，从而避免被宿主免疫系统清除而能够在宿主体内生存。

细菌生长繁殖离不开铁离子，但由于其自身无法生产铁离子，只能通过强夺宿主的转铁蛋白及乳铁蛋白中的铁为其提供必需的铁离子。Charlnad 等的研究表明，HPS 可以通过Tbp1 提供细菌生长必需的铁离子，Tbp1 可能在HPS 致病过程中起关键性作用[10]。本研究表明HPS 血清5 型菌株的Tbp1的表达丰度超过血清4 型菌株3.39 倍，该蛋白有作为潜在的药物治疗靶点的可能。

热休克蛋白是一类应激反应性蛋白，包括HSP70、HSP40 和GrpE 等家族蛋白，广泛存在于原核细胞和真核细胞中。热休克蛋白家族蛋白间的协同作用，促使某些能够自发折叠的蛋白质正确折叠，形成天然空间构象，本研究中，HPS 血清5 型菌株的GrpE 蛋白表达量为血清4 型菌株的3.33 倍，其潜在的生物学机制还有待进一步研究。同时，尚有7 个蛋白的功能不清楚，有待进一步挖掘，特别是表达丰度差异较大的蛋白更是值得深入研究。

HPS 菌株的外膜蛋白差异极大，而脂多糖成份则很相似，表明HPS 细胞膜的结构与其血清型的区分具有密切关系[11-12]。本研究表明，HPS 血清5 型菌株表达上调的蛋白中，有6 个蛋白与细胞膜的形成有关，特别是外膜蛋白P5，它是细菌定植在宿主上呼吸道表面的必需因子[13-14]，我们此次检测到的外膜蛋白P5，在HPS 血清5 型菌株中的表达丰度为血清4 型菌株的2.17 倍。因此，外膜蛋白P5 有可能为HPS 菌株间血清型差异的一个影响因子。

本研究应用iTRAQ 技术结合质谱分析，对HPS血清5 型和血清4 型菌株的差异表达蛋白进行了初步分析，获得的差异表达蛋白将为后续HPS 的研究提供线索。

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