宿主miRNA调节沙门氏菌感染的研究进展

刘亚娟，保 雨，彭祥伟，刘 力*，石宝石

(1.西南大学 动物科技学院，重庆 400716；2.重庆市畜牧科学院 家禽研究所，重庆 400015)

MicroRNAs(miRNA)是由真核细胞表达的一类长约19 nt～25 nt 的内源性非编码小RNA 分子，在调控宿主转录后的基因表达起着关键作用，为免疫细胞中的关键分子。在动物、植物以及病毒中均能够检测到miRNA 的存在，通过miRBase 数据库查到目前为止发现的miRNA 共有28 645 种，其中已经确定的小鼠miRNA 有1 000 多种，人有1 500 多种，在哺乳动物中，miRNA 控制了30 %～50 %蛋白编码基因的活动。miRNA 基因可能以单个的形式存在，也可能以基因簇的形式存在，基因簇通常经多顺反子转录本一起转录，并且调控mRNA 的相关功能，从而控制基因的表达[1-3]。

沙门氏菌是一种胞内感染的病原菌，沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，如轻微的自限性胃肠炎和致命的系统性伤寒症。沙门氏菌可以通过逃避机体的天然和获得性免疫，调节宿主细胞功能以及自身第三分泌体系(Type III secretion systems，T3SS)顺利侵入宿主细胞[4-5]。相关研究发现miRNA 是沙门氏菌感染宿主细胞过程中的关键因子，miRNA 和信号通路的相互作用成为调节沙门氏菌感染的重要因素，为了深入理解这一机制，本文就最新研究进展作一综述。

1 miRNA的发现及合成

lin-4 是1993 年在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中发现的首个微小RNA，随后发现lin-4 可以调控lin-14 的表达，从而证实这类微小RNA 有调控作用[6]，并命名为miRNA。7 年后，再次在C.elegans 中发现了第二种miRNA：let-7，并且同年在人类、果蝇属和其它两性动物细胞中都发现了let-7[7]。随后的十几年中，越来越多的miRNA 被发现，其功能的研究也更加深入，证实了这类非编码小分子RNA 在整个生命进程中发挥至关重要的作用。

miRNA 的合成主要分为两种途径：(1)经典合成途径，miRNA 在细胞核内经RNase II 转录成含有一个或多个环状发夹结构、几百至几千nt 的pri-miRNA。pri-miRNA 被RNase III 内切酶家族Drosha 或双链RNA 结合蛋白DGCR8 切割成70 nt 的pre-miRNA。(2)非经典合成途径中，有一种新亚型miRNA 前体(mirtrons)，与pri-miRNA不同，mirtrons 没有环状结构以及侧单链的部分，所以它不依赖于Drosha 或DGCR8 的裂解，而是经剪接体处理形成分支pre-mitrons，套索脱支酶去支生成pre-miRNA。接着在转运蛋白Exportin-5 的作用下将pre-miRNA 从细胞核运送到细胞质中，经RNase III 酶Dicer 处理形成22 nt 的miRNA/miRNA* 二聚体后进入Argonaute 蛋白，生成RNA诱导沉默复合物(RISC)，miRNA 在RISC 中作为成熟miRNA 发挥作用，miRNA* 则被降解。成熟miRNA 在RISC的作用下，其2 nt～8 nt 的“种子区域”与靶mRNA3' 端非翻译区(UTR)互补结合，根据互补情况，对靶mRNA 进行翻译抑制或靶向降解，从而调控基因的表达[2]。

2 抗沙门氏菌感染相关miRNA

沙门氏菌LPS 刺激细胞后，宿主通过细胞膜上的Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)和细胞质中的Nod 样受体(Nod-like receptors，NLRs)识别病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，诱导细胞相关miRNA 表达，miRNA 又通过调节TLR 和NOD 介导的信号通路抵抗细菌的侵入。沙门氏菌等革兰氏阴性菌的LPS 是TLR4 最重要的配体，因此miRNA 主要作用于TLR4 相关信号通路(图1)。

图1 宿主miRNA 对沙门氏菌的调节[8]

2.1 let-7家族 let-7 家族的序列和功能在进化过程中高度保守，免疫调节性细胞因子IL6 和IL10 作为新发现的let-7 靶标，let-7 能与它们的3'UTR 序列互补，抑制TLR4介导的IL6 和IL10 产生，相反IL6 也可通过NF-kB 抑制let-7a 的表达[9]。Schulte 等研究表明let-7 家族成员let-7a/c/d/f/g/I、miR-98 在巨噬细胞和上皮细胞感染沙门氏菌后表达下调，促炎和抗炎因子IL6、IL10 分泌，分别促进和抑制了IL1、TNF-α 的释放，参与免疫应答平衡调节，控制炎症反应[10]。

2.2 miR-146 Sharbati 等通过新建立的miR-Q 法测得人单核巨噬细胞THP-1 感染沙门氏菌后miR-146a/b 表达上调，发挥调控作用[11]。Nahid 等也证实，LPS-TLR4/NF-kB信号通路与炎症的发生密切相关，将沙门氏菌LPS 刺激THP-1 后，miR-146a 表达上调，在固有免疫应答中对该信号通路具有负反馈调节作用，促炎性细胞因子TNF-α 分泌减少，防止炎症的过度发生。此外，miR-146a 对TLR2，TLR5 等TLR 家族成员(TLR3 除外)也有抑制作用，因为miR-146a 的靶标IRAK-1 和TRAF6 信号介质在它们诱导的炎症反应中处于关键位置，所以沙门氏菌感染后miR-146a 对TLR 信号通路有交叉调节作用[12]。髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)是除TLR3 外TLR 信号转导通路中的关键转接分子，Anita 等阻断MyD88-TRAF6 信号通路，发现miR-146 表达受到抑制，但并非完全抑制，推测沙门氏菌LPS 激活TLR4/NF-kB 的两条主要途径MyD88-TRAF6 依赖性和MyD88 非依赖性信号通路都有助于miR-146 的表达。研究显示载脂蛋白与免疫调节有关，通过抑制miR-146a/b 的表达，发现载脂蛋白基因家族的6 个成员apoa1a 等表达增加。推测宿主在感染沙门氏菌引起的炎症反应中，过表达的miR-146 通过TLR4 介导的信号途径引起IL6、IL8 和MMP9 分泌，并调节载脂蛋白介导的脂质运输，控制脂质的新陈代谢，防止脂蛋白在THP-1 巨噬细胞中堆积引起动脉粥样硬化[13]。

2.3 miR-155 miR-155 是B 细胞整合簇基因(B-cell Integration Cluster，BIC)的表达产物，能够促进B 细胞增殖及细胞因子表达[1]，miR-155 在TLR 配体和细胞因子的刺激下均能升高，胞质溶胶中NLR 家族的NOD2 分子在沙门氏菌刺激后通过NF-kB 增强miR-155 的表达，调节炎症反应。Tili 等用沙门氏菌LPS 刺激小鼠RAW 264.7 细胞，TNF-α 表达水平显著升高，miR-155 表达上调[14]。miR-155既可通过上调TNF-α 正调控LPS 介导的信号传导通路，也可通过靶向结合IKKε 抑制NF-κB 的激活以及抑制FADD 和Ripk1 的转录本负调控这些通路。但LPS 刺激后IL10 可通过STAT3 信号通路作用于BIC 基因抑制miR-155 的表达，其靶标SHIP1 表达上调，抑制TLR4 信号通路中PI3K 激活NF-κB 和MAPK 促进的炎症反应[15]。miR-155 可以靶向结合IFNGR1 的mRNA，降低miR-155 的浓度会使IFNGR1 RNA 含量增加，沙门氏菌感染后，动物体内IFNGR1 RNA 含量大量升高，但在分泌少量沙门氏菌的动物体内升高并不明显，同时miR-155 对体内基因表达调节因子SPI1、CEBPB 以及TLR4 有抑制作用，与IFN-γ 共同影响细菌分泌量[16]。因此miR-155 的表达上调能使受感染动物分泌沙门氏菌量减少，降低动物之间疾病传播的可能性，预防了对公共健康的危害。

2.4 miR-27 Xie 等发现miR-27a 增强促炎性细胞因子的表达，感染沙门氏菌后巨噬细胞中miR-27a 表达下调，减少对IL10 依赖的STAT3 磷酸化作用的抑制，IL10 分泌增加，防止TLR2 和TLR4 引发的过度炎症反应[17]。miRNA 的作用大致分为两类：精细调节和靶向降解。精细调节可以促进细胞的分化，靶向降解则可以降低基因表达的变异水平。基因表达“噪音”是某些等位基因，与主体基因表达不同，这种表达的蛋白与整体有差异，因此是一种“噪音”。miRNA 与一种非相干的前馈回路共同作用可以防止基因表达“噪音”，减少基因表达的变异。miR-27b，miR-144，miR-145，miR-2483，miR-296 和miR-324 的靶标huR 是一种RNA 结合蛋白基因，调控炎症反应，它的变异与许多疾病的发生有关。沙门氏菌感染时，由于miRNA 对“噪音”的抑制作用，huR 表达变异水平降低，与机体共同抵抗沙门氏菌的侵入[18]。

2.5 miR-15家族 最新研究发现沙门氏菌在宿主中增殖与miRNA 调节细胞周期有关。宿主细胞周期可分为G0/G1、S、G2 及M 4 个阶段，由于miR-15 的作用G1 生长期阻滞会抑制胞内沙门氏菌的增殖。在G1 生长期前，肿瘤抑制因子RB 与转录因子E2F-DP1 结合限制了其活性，当细胞周期蛋白D1 和细胞周期蛋白激酶CDK4/6 相互作用激发RB 蛋白磷酸化后，释放了E2F-DP1，E2F-DP1 结合到基因组上，促进周期蛋白E 和CDK2 的表达，使细胞周期从G1 期顺利进入到S 期。沙门氏菌感染细胞后发生内化作用，激活型E2F1 转录因子受到抑制作用，E2F1 调控的miR-15 家族表达下调，进而解除了对D1 蛋白的抑制作用，G1 期进入到S 期，沙门氏菌得以顺利在细胞内生存并增殖。另外，沙门氏菌毒力岛SPI-2 编码的T3SS 效应蛋白SpvB 会使细胞长期停滞在G2-M 期，有利于沙门氏菌的生长增殖[19]。

3 协助沙门氏菌感染相关miRNA

沙门氏菌通过细胞信号通路上调miRNA 或编码miRNA 调控作用，调节肠上皮细胞HT-29 中部分成分的功能，破坏宿主的自我防御机制，使沙门氏菌逃过机体防御成功侵入宿主细胞。

3.1 miR-29a Hoeke 等经Co-IP 检测到HT-29 中的小窝蛋白2(caveolin-2，CAV 2)可以与Rho GTP 酶CDC42 蛋白聚集，CAV 2 发挥或协同GDP 解离抑制因子的作用，抑制CDC42 蛋白的活性。并发现miR-29a 通过CDC42 蛋白调节粘着斑和肌动蛋白细胞骨架之间的连接使沙门氏菌更易感染小猪肠道，具体表现在沙门氏菌感染后，回肠中miR-29a 表达上调，通过FAK 信号通路使SRC 激酶促进CAV 2 上的酪氨酸19 磷酸化，CAV 2 失活并从CDC42复合体中分离，CDC42 蛋白与GTP 结合被活化导致丝状伪足形成，从而有助于沙门氏菌侵入[20]。推测今后可以通过切断miR-29a-FAK 信号通路来阻止沙门氏菌的感染。

3.2 miR-128 miR-128-2 位于ARPP-21 基因的内含子内，突变型p53 蛋白可与ARPP-21 基因的启动子结合使ARPP-21 mRNA 和miR-128-2 的表达增加[21]。miR-128 可以靶向结合巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的3'UTR 区。肠炎沙门氏菌的分泌蛋白作用于p53 信号通路使HT-29 中的miR-128 表达上调，抑制细胞内M-CSF 的表达和分泌以及M-CSF 介导的巨噬细胞集落，抵抗宿主的免疫应答，从而使自身免受巨噬细胞的吞噬和清除。经胃内投放miR-128 miRNA 拮抗剂可以增加M-CSF 介导的巨噬细胞集落，敲除p53 后miR-128 表达严重下调，两者都不利于沙门氏菌的侵入[4]。

3.3 miRNA样RNA miRNA 可以作为“向导”miRNA，通过基因沉默子Argonaute 2 蛋白结合并降解其靶基因的RNA 转录本，使其无法翻译为蛋白。Gu 等在感染沙门氏菌的HT-29 细胞中检测到一组沙门氏菌衍生的19 nt～24 nt非编码RNA 片段：Sal-1。Sal-1 能够抑制上皮细胞内炎症相关的诱生型一氧化氮合酶表达，使宿主细胞减少一氧化氮的释放，增强细菌在细胞内的增殖能力。在小鼠的结肠上皮表达或敲除Sal-1，能够显著地提高或降低沙门氏菌对小鼠的感染。前Sal-1 成为成熟Sal-1 并不依赖Dicer 酶的作用，而依赖于Argonaute 2 蛋白，因此沙门氏菌可以通过“挟持”哺乳动物miRNA 调控靶RNA 的作用机制，形成功能性miRNA 样RNA 调节宿主细胞功能，推测这可能是一种新型的毒力因子[22]。

4 协沙门氏菌抑制炎症相关miRNA

TLR8、CCL17 和CCL22 对炎症的发生都有促进作用，TLR8 是促炎细胞因子的“诱发剂”，在患有特异性皮炎的幼鼠外周血单核细胞表达升高；CCL17、CCL22 与Th2 相关的皮肤炎症都有直接关系，它们在血清中浓度的升高会使IL-4 分泌增加，IFN-γ 分泌减少，引起严重的特异性皮炎[23-24]。

当miRNA 和靶基因mRNA 几乎完全配对时，miRNA能诱导mRNA 降解或阻碍其翻译，miRNA 可通过这种基因沉默机制抑制基因的表达[25]。在活化的淋巴细胞中，CCL17 miRNA、CCL22 miRNA 和TLR8 miRNA 分别负调控CCL17、CCL22 和TLR8 基因。Yoon 等先后将这3 种miRNA 克隆至表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR 并转入沙门氏菌中，构建重组菌株ST-miR CCL17(S.typhimurium expressing CCL17 miRNA)、ST-miR CCL22 和ST-miRTLR8，抑制了动物体内CCL17、CCL22 和TLR8的表达。给患有特异性皮炎的小鼠接种ST-miRCCL17 和ST-miRCCL22 后，CCL17、CCL22 水平降低，IL-4 被抑制，IFN-γ 水平升高。给注射2，4-二硝基氯代苯(皮肤致敏物)的小鼠接种ST-miRTLR8 后，小鼠血清中IL-4、IgE和IFN-α 的水平明显降低，IFN-γ 水平升高，两者均有效地减少了小鼠的抓伤[26-28]。

Yoon 等利用RNA 干扰过程中miRNA 由聚合酶II 启动子表达调控的优势，采用RNA 干扰机制抑制炎症相关基因的表达，使 ST-miR CCL17、ST-miR CCL22 和ST-miR TLR8 3 种重组菌株对小鼠的特异性皮炎都有显著的治疗效果，启示可以利用miRNA 与趋化因子的结合，研制沙门氏菌治疗皮炎相关药物。ST-miR CCL22 抑制CCL22 的表达还可以引起Th1 型免疫应答，防止Th1 型和Th2 型免疫应答失衡引起的相关疾病。

5 结语

miRNA 广泛存在于动物体内，沙门氏菌作为一种引发动物疾病的常见病原菌，它与miRNA 之间的形成了一个复杂的网络，调节机体的防御机制。细菌可以通过分泌效应蛋白进入宿主细胞，从而改变宿主细胞功能来确保自身的存活和复制，其中一些效应蛋白能够直接或间接地操控哺乳动物miRNA 的途径，沙门氏菌可以编码超过30 种效应蛋白。了解沙门氏菌和宿主miRNA 之间的相互作用以及它们与动物体内信号通路的联系，找出更多的相关miRNA 和转录因子，对miRNA 进行靶基因预测，可以为今后沙门氏菌病的治疗提供新方向，也能够进一步认识高等真核生物复杂的基因表达调控网络。

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