大肠杆菌耐热肠毒素基因多拷贝串联表达及其单克隆抗体的制备

韩林林，阿力马斯别克·哈山，李金萍，唐 杰，刘文鑫，关玮琨，李星月，赵志腾，师东方*

(1.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.铁买克乡畜牧兽医站，新疆 富蕴 836302)

产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起幼畜腹泻的主要病原之一，通过菌毛与易感宿主小肠黏膜上皮细胞上的特异性受体结合定植，然后大量增殖，产生肠毒素引起腹泻[1]。ETEC 产生的肠毒素有不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)和耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST)，ST 可以分为STa 和STb，STa 能够引起动物和人腹泻，STb 仅引起动物发生腹泻[2]。STa 分为STp(猪源)和STh(人源)两种亚型，其中STp 可以引起仔猪、犊牛和人发生腹泻，而STh 只在人腹泻粪便的ETEC 中检测到[3-4]。STa 分子量小(约2 ku)，STp 由18 个氨基酸构成，不能被蛋白质染色剂染色，也不能作为抗原包被ELISA 板，缺乏免疫原性，不能直接用其免疫动物制备血清抗体，这些特点均阻碍了检测方法的建立[5]。

Lockwood 利用纯化的STa 与牛血清白蛋白(BSA)共价结合作为免疫原，免疫动物获得了抗STa高免血清，用纯化的STa 与人血清白蛋白(HAS)共价结合作为抗原包被ELISA 板，利用抗STa 高免血清建立了竞争ELISA[6]，由于该方法的抗原制备过程复杂，其应用受到了限制。国内虽有STa 单克隆抗体(MAb)制备的报道，但对所用的免疫原未明确说明[7]。目前仍使用乳鼠灌胃试验进行检测[8]，给研究带来许多不便。

本研究通过STp 编码基因(estp)重复串联并表达制备具有免疫原性的重组蛋白，并利用该重组蛋白作为免疫原免疫小鼠，制备抗STp 的特异性MAb，为STa 检测方法的建立奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌种、质粒、细胞和实验动物 E.coli 株C83915(O9:K103，987P，STa+)购自中国兽医药品监察所；E.coli DH5α，LT、STb、Stx2e、Stx1、Stx2等E.coli 毒素，重组蛋白MBP-5STp(由重组E.coli pMAL-c4x-5estp/Rosetta 表达制备)、pGEX-6P-1 载体、重组E.coli pMAL-c4x/Rosetta、SP2/0 骨髓瘤细胞均由本实验室制备或保存；E.coli BL21(PlySs)购自北京全式金生物技术有限公司；清洁级8 周龄BALB/c 小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂 限制性内切酶、DNA 分子质量标准购自TaKaRa 公司；T4 连接酶、蛋白质分子质量标准、核酸胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自北京中科瑞泰生物科技有限公司；Honda 氏产毒肉汤基础培养基购自青岛日水生物制品有限公司；HRP 标记羊抗鼠IgG(IgG-HRP)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；抗His 鼠源MAb 购自天根生化科技(北京)有限公司；MAb 亚类鉴定试剂盒购自赛尔维实验器材有限公司。

1.3 estp基因合成 参照GenBank 登录的STp 成熟肽核苷酸序列(V00612.1)和E.coli 密码子偏好性设计两段序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并以质粒和重组菌形式提供，即pUC57-estp-linker/DH5α 和pUC57-estp-his/DH5α。具体序列如下：estp-linker：(Bam HⅠ)5'-GGATCCAACACCT TTTATTGCTGTGAACTGTGCTGTAACCCGGCGTGC GCGGGCTGCTATGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTG GCGGTAGCAGATCTTAAGTCGAC-3'(BglⅡ，SalⅠ)；estp-his：(Bam H Ⅰ)5'-GGATCCAACACCTTTTATT GCTGTGAACTGTGCTGTAACCCGGCGTGCGCGGG CTGCTATCATCATCATCATCATCATTAAGTCGAC-3'(SalⅠ)。

1.4 串联基因estp5-his构建 利用Bam HⅠ和BglⅡ这两个同尾酶将estp-linker 串联3 次后与estp-his 进行第4 次串联，构建重组质粒pUC57-estp-linker-estplinker-estp-linker-estp-linker-estp-his(pUC-estp5-his)。并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。鉴定正确的串联基因片段命名为estp5-his。

1.5 重组蛋白STp5-His(rSTp5-His)表达及鉴定将pUC57-estp5-his 利用Bam HⅠ/SalⅠ双酶切后，克隆于pGEX-6p-1 中，构建重组表达质粒pGEX-estp5-his，并转化于E.coli BL21(PlySs)中，经IPTG 诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE 分析并转印于NC膜，以抗His MAb(1∶500)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)为二抗进行western blot 鉴定。鉴定正确的重组蛋白命名为STp5-His。

1.6 天然STa的粗提 参照文献[9]的方法，将E.coli 株C83915 接种50 mL Honda 氏产毒肉汤基础培养基，37 ℃200 r/min 振荡培养16 h 后接种入含有3 L Honda 氏产毒肉汤培养基的生物发酵罐，添加0.02 %止泡剂，溶氧度为45 %、pH8.5，39 ℃发酵24 h；离心收集培养物上清液，将上清液过XAD-2 大孔吸附树脂，用闪蒸的方法浓缩洗脱液至100 mL；用5 倍体积的丙酮萃取，离心收集上清液，闪蒸浓缩至30 mL。测定蛋白浓度(紫外分光度计法)，分装，-70 ℃保存。

1.7 MAb的制备

1.7.1 动物免疫及阳性杂交瘤细胞株的制备与筛选以rSTp5-His 为免疫原，腹腔注射免疫8 周龄雌性BALB/c 小鼠，免疫4 次，每次间隔14 d，每次剂量为0.1 mL/只。第4 次免疫3 d 后选取血清抗体效价达到1∶12 800 以上的小鼠进行加强免疫，3 d 后进行细胞融合。以重组蛋白MBP-5STp 为包被抗原，通过间接ELISA 方法筛选阳性杂交瘤细胞株，并利用有限稀释法进行克隆纯化，获得稳定分泌特异性MAb 的阳性杂交瘤细胞株。

1.7.2 腹水的制备与纯化 按文献[10]的方法进行BALB/c 小鼠腹水MAb 的制备，并采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水IgG。

1.8 MAb的生物学特性分析

1.8.1 MAb 效价及亚类鉴定 将各株杂交瘤细胞株培养上清液从1∶400 开始稀释，腹水MAb 1∶1 000开始稀释，SP2/0 细胞培养上清液为阴性对照，采用间接ELISA 测定其效价，效价为P/N>2 的最大稀释倍数。

根据抗体亚类试剂盒说明书进行各株杂交瘤细胞亚类的鉴定。

1.8.2 MAb 的western blot 鉴定 将纯化的重组蛋白MBP-5STp、重组菌pMAL-c4x/Rosetta 诱导表达产物进行SDS-PAGE 电泳后，转印NC 膜，以杂交瘤细胞培养上清液为一抗，羊抗鼠IgG-HRP 为二抗进行western blot 鉴定。

1.8.3 MAb 的阻断ELISA 分析 参照文献[11]，利用阻断ELISA 检测MAb 对天然STp 蛋白的反应性。用重组蛋白MBP-5STp(1.4 μg/mL)包被反应板，100 μL/孔，4 ℃包被16 h；5 %脱脂乳封闭2 h。将稀释后的杂交瘤细胞上清液与1∶20 稀释的粗提STp等体积混合，37 ℃孵育1 h，以Honda 氏培养基作为对照。加入羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃1 h；TMB 显色液显色3 min～4 min，2 M 硫酸终止反应，读取OD450nm值并计算阻断抑制率。阻断抑制率(%)=(阴性-阳性)/阴性×100 %。

1.8.4 MAb 特异性鉴定 参照上述方法，以重组蛋白MBP-5STp 包被反应板，将LT+STb、Stx2e、Stx1+Stx2 毒素分别与杂交瘤细胞上清液混合孵育，Honda 氏产毒培养基做阴性对照，粗提天然STa 做阳性对照，利用阻断ELISA 分析4 种MAb 的特异性。

2 结果

2.1 estp5-his串联基因和重组表达质粒pGEXestp5-his的鉴定 pUC57-estp5-his 经双酶切后克隆至pGEX-6p-1 载体中构建重组表达质粒pGEXestp5-his，经酶切鉴定结果显示，目的片段大小约为450 bp，与预期大小相符(图略)。测序结果也与预期参考序列相同。

2.2 rSTp5-His的鉴定 重组菌pGEX-estp5-his/E.coli BL21(PlySs)经IPTG 诱导表达后，培养物上清液和包涵体经SDS-PAGE 分析，结果显示，rSTp5-His 以包涵体形式表达，大小约为38 ku(图1A)；western blot 分析结果表明该重组蛋白可以与His MAb 发生特异性反应(图1B)。

图1 rSTp5-His 表达的SDS-PAGE(A)和western blot(B)分析Fig.1 SDS-PAGE(A)and western blot(B)analysis of rSTp5-His

2.3 杂交瘤细胞株的筛选 杂交瘤细胞经3 次克隆纯化后共筛选出4 株稳定分泌抗MBP-5STp MAb 的杂交瘤细胞株，分别命名为C3、G1、F3 和G9。MAb 亚类鉴定及细胞培养上清液效价见表1。

表1 MAbs 特性Table 1 The characteristics of the MAbs

2.4 腹水的制备 取C3 和G1 杂交瘤细胞株按常规方法制备腹水，经改良的辛酸/饱和硫酸铵法纯化后，MAb C3 IgG 的浓度为4.7 mg/mL，MAb G1 IgM 的浓度为0.9 mg/mL。间接ELISA 检测C3 和G1 腹水效价分别为1∶1×106和1∶1×105。

2.5 MAb的western blot分析 以MBP-5STp 为检测蛋白，对4 株MAb(C3、G1、F3 和G9)进行western blot 分析，结果显示，4 株MAb 均与蛋白MBP-5STp 反应，在58 ku 处出现特异性条带，而重组菌pMAL-c4x/Rosetta 则无任何条带(图2)。

图2 MAb 的western blot 分析Fig.2 Analysis of the MAbs by western blot

2.6 天然STp的粗提 按方法1.6 提取的天然STp浓度约为238.9 mg/mL，未经萃取浓缩的细菌培养上清液中STp 浓度约5.5 mg/mL。初步提取后STp的浓度约是提取前的40 倍。

2.7 MAb的阻断ELISA分析 采用阻断ELISA 对MAbs 进行分析，首先将MAb 与天然STp 混合孵育，然后加入包被抗原的ELISA 板，计算天然STp阻断MAb 与包被抗原的结合率。结果表明，天然STp 可以阻断4 株MAb 与检测抗原的反应，阻断抑制率均大于80 %，表明4 株MAb 能够与天然STp发生免疫反应(表2)。

表2 阻断ELISA 结果Table 2 Results of the blocking ELISA

2.8 MAb特异性鉴定 用阻断ELISA 检测MAb 的特异性，结果显示，LT+STb、Stx2e、Stx1+Stx2 对MAb 与检测抗原反应的阻断抑制率均小于20 %，而天然STp 对MAb 与检测抗原反应的阻断抑制率大于70 %(表3)。表明MAb 仅与天然STp 发生特异性免疫反应。

表3 阻断ELISA 检测MAb 特异性Table 3 Specificity analysis of MAbs by blocking ELISA

3 讨论

肠毒素是ETEC 的主要致病因子，也是鉴定ETEC 的主要依据。LT 具有免疫原性，可以通过免疫动物制备抗体或MAb 用于检测LT。魏燕玲等用亲合层析纯化的LT 免疫BALB/c 小鼠制备了MAb，并以其建立了检测LT 的双抗体夹心ELISA[12]。STa分子量小，不具有免疫原性，不能够直接免疫动物制备抗体或MAb，因此限制了STa 血清学检测方法的进展。虽然通过将STa 与其他大蛋白共价结合或融合表达后免疫动物可以制备抗STa 抗体[6,13]，但由于STa 在免疫原中的比重过小，往往不能刺激机体产生高效价抗体。近年来，相同抗原表位的重复多拷贝串联表达为增强小分子量多肽的抗原性提供了新的途经。刘思国等将猪瘟病毒E2 蛋白aa829～aa837 处的抗原表位基因进行了单一表位和重复多拷贝融合表达并免疫家兔，结果显示，用单一表位重组蛋白免疫3 次后，家兔只产生较低水平的血清抗体，而用重复多拷贝表位重组蛋白第2 次免疫后，家兔即产生了较高水平的血清抗体，表明重复多拷贝表位重组蛋白具有更好的免疫原性[14]。

本研究将estp-linker 串联3 次后再与estp-his 串联，表达的rSTp5-His 分子量约38 ku，远大于STp分子量(2 ku)，不仅在重组蛋白中增加了抗原表位，而且与单表位重组蛋白相比加大了空间结构，免疫小鼠产生了高效价的特异性抗体。经4 次重复串联estp 基因后表达的重组蛋白MBP-5STp(58 ku)作为检测抗原包被ELISA 板，实现了对小鼠免疫抗体的直接检测。研究结果表明，通过estp 的重复串联表达，可以使不具有免疫原性的STp 具有良好的免疫原性。利用rSTp5-His 作为免疫原制备的MAb 与天然STp 能够发生特异性免疫反应，STp 可以阻断MAb 与检测蛋白的特异性结合，展现了该MAb 对建立STp 的检测方法的重要应用价值。本研究通过构建5 拷贝基因串联体达到了提高STp 免疫原性的目的，其他拷贝数基因串联体表达的重组蛋白的免疫原性，有待于进一步研究。

[1]高研，李卫芬，马国霞.产肠毒素大肠杆菌主要致病因子及其致病机理的研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2006，5：2-5.

[2]Echeverria P,Seriwatana J,Taylor D N,et al.Identification by DNA hybridization of enterotoxigenic Escherichia coli in a longitudinal study of villages in Thailand[J].J Infect Dis,1985,151(1):124-130.

[3]Moseley S L,Hardy J W,Hug M I,et al.Isolation and nucleotide sequence determination of a gene encoding a heat-stable enterotoxin of Escherichia coli[J].Infect Immun,1983,39(3):1167-1174.

[4]Saeed A M,Greenberg R N.Preparative purification of Escherichia coli heat-stable enterotoxin[J].Anal Biochem,1985,151(2):431-437.

[5]Thompson M R,Brandwein H,Labine-Racke M,et al.Simple and reliable enzyme-linked immunosorbent assay with monoclonal antibodies for detection of Escherichia coli heat-stable enterotoxins[J].J Clin Microbiol,1984,20(1):59-64.

[6]Lockwood D E,Robertson D C.Development of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for Escherichia coli heat-stable enterotoxin(STa)[J].J Immunol Methods,1984,75(2):295-307.

[7]管翠萍，贾伟，陈萍萍.抗大肠杆菌耐热性肠毒素ST1 单克隆抗体的制备与鉴定[J].安徽农业科学，2009(18)：8362-8363.

[8]Liu Wen-xin,Yuan Chao-wen,Bao Jun,et al.Generation of an attenuated strain oral vaccine candidate using a novel double selection platform in Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2014,99(2):855-867.

[9]Aref N E,Saeed A M.An enhanced protocol for expression and purification of heat-stable enterotoxin of enterotoxigenic Escherichia coli[J].J Biochem Mol Toxicol,2012,26(4):168-175.

[10]周玉，李岩松，潘风光，等.小鼠腹水IgG 类单克隆抗体纯化方法的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2006，10：14-16.

[11]丁琳，师东方，付海兵，等.志贺样毒素Ⅱ型变异体B 亚基单克隆抗体的制备[J].中国预防兽医学报，2009，31(03)：222-225.

[12]魏燕玲，张意仲，黄上媛，等.单克隆抗体ELISA 检测产毒大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的应用研究[J].中国人兽共患病杂志，1988，5：4-7.

[13]Zhang Wei-ping,Zhang Cheng-xian,Francis D H,et al.Genetic fusions of heat-labile(LT)and heat-stable(ST)toxoids of porcine enterotoxigenic Escherichia coli elicit neutralizing anti-LT and anti-STa antibodies[J].Infect Immun,2010,78(1):316-325.

[14]Liu Si-guo,Yu Xing-long,Wang Chun-lai,et al.Quadruple antigenic epitope peptide producing immune protection against classical swine fever virus[J].Vaccine,2006,24(49-50):7175-7180.