鸡毒支原体HS株p MGA1.2重组蛋白的免疫保护性研究

胡思顺，王晓丽，陆时娟，张金娟，李自力，许青荣，刘 梅，毕丁仁*

(1.华中农业大学 动物医学学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070)

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)引起的慢性呼吸道疾病已成为我国养鸡业中一种重要的疾病，鸡群平均感染率高达80 %[1]。尽管MG 弱毒疫苗在防控MG 中起到一定程度的作用，但弱毒疫苗株存在散毒和毒力返强的风险[2]。因此，亟需研发更安全的疫苗以便有效的控制MG 感染。

国外的研究表明体液免疫并不能有效抵抗MG感染，而粘膜抗体(IgA)和细胞免疫可能更重要[3]。MG 黏附素蛋白pMGA 为MG 主要的抗原性蛋白，可以诱导机体产生局部抗体，具有一定的粘膜免疫原性[4]。但因为没有进一步的动物实验数据报道，相应的抗体是否具有免疫保护作用尚不清楚。本实验室前期研究表明pMGA1.2 属于HS-MG 的40 个黏附素成员之一，不显性表达黏附素蛋白，但pMGA1.2 重组蛋白(rpMGA1.2)能够与MG 阳性血清发生免疫学反应，表明MG 黏附素蛋白存在交叉反应抗原表位[5-7]。本研究对pMGA1.2 对鸡胚气管粘膜的黏附特性及在MG 吸附过程的作用进行研究，同时佐以霍乱毒素B 亚单位(CTB)点眼滴鼻接种SPF鸡研究pMGA1.2 的粘膜免疫能力和抗感染的应用潜力，为进一步研究和开发MG 亚单位疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 MG-HS 株由本实验室保存；重组质粒pKG-pMGA1.2 和pKG-CTB 由本实验室构建；19 日龄SPF 鸡胚购自华中农业大学实验鸡场；1 日龄艾维因肉鸡购自湖北正大集团。

1.2 rp MGA1.2对MG定植鸡胚气管环粘膜的影响参照文献[8-9]的方法无菌制备鸡胚气管环培养物。实验组分3 组，分别加入50 μg、100 μg 和200 μg rpMGA1.2 孵育气管环0.5 h，用DMEM 洗涤气管环3 次，每次5 min，加入等量培养液和适量MG-HS继续培养，分别取培养24 h 和48 h 的气管环进行电镜扫描，参照文献[10]的影像形态测量法，对电镜扫描图片反映的气管上皮纤毛脱落程度进行评分，评价气管环受损情况和rpMGA1.2 对MG 黏附抑制效率。同时设置PBS 处理对照组。用t 检验分析2 次独立试验结果。

1.3 rpMGA1.2粘膜免疫保护试验 将90 只7 日龄雏鸡随机平均分成6 组，隔离饲养，分别进行点眼滴鼻免疫试验和攻毒试验。其中第1 组接种PBS，第2 组～6 组每只分别接种10 μg 空载体表达产物(Vector 组)、10 μg 重 组CTB(rCTB)、10 μg rpMGA1.2、10 μg rCTB+10 μg rpMGA1.2(rCTB/rpMGA1.2low)和10 μg rCTB+20 μg rpMGA1.2(rCTB/rpMGA1.2high)，免疫后第7 d 进行加强免疫一次，rpMGA1.2 剂量加倍，rCTB 剂量不变。免疫后第14 d接种MG-HS 109ccu/只。每天早晚观察记录鸡群健康状况，攻毒后10 d，参考文献[11]的方法记录实验鸡气囊的病理变化。

1.4 样品的采集与检测 试验前随机抽取3 只鸡，收集其血清、鼻腔洗液、气管洗液，-20 ℃保存备用。免疫后每周每组取3 只实验鸡进行安乐死处理后收集其血清、鼻腔洗液、气管洗液，其余鸡全部翅静脉采血，每只约0.8 mL，分离血清。处理后的样品置于-20 ℃保存备用。将适量MG 超声波破碎裂解物作为包被抗原，以兔抗鸡IgG-HRP(1∶2 000)或羊抗鸡IgA-HRP(1∶10 000)为二抗建立ELISA 方法分别检测抗MG 特异性抗体IgG 和MG-IgA。

2 结果

2.1 rp MGA1.2对MG定植鸡胚气管环粘膜的影响正常体外培养鸡胚气管环粘膜表面气管环界限清楚、上皮细胞表面覆盖一层规则伸展的纤毛、并有短纤毛的细胞“补丁”(图1A-B)，表面的纤毛活力在体外培养9 d 后基本散失。接种MG 后24 h～48 h，气管环间的界限模糊、粘膜表面不平、上皮细胞出现脱落，纤毛顶端肥大并相互粘连，出现不同程度脱落等病变(图1C-D)。鸡胚气管环经rpMGA1.2 预处理后再接种MG，MG 对气管环的损伤作用得到抑制(图1E-F)，实验组与对照组差异显著。在MG接种24 h 后，不同剂量rpMGA1.2 处理组间气管环变化差异不显著(p>0.05)，但在MG 接种48 h 后，高、中剂量预处理组与低剂量预处理组的气管环变化差异显著(p<0.05)(表1)。这表明pMGA1.2 具有抑制MG 定植鸡气管粘膜的作用。

图1 鸡胚气管环粘膜表面纤毛电镜扫描图片Fig.1 The SEM pictures of cilia on the surface of chick embryo tracheal mucosa

表1 气管环纤毛变化情况评分结果Table 1 Results of cilia state in tracheal rings

2.2 实验鸡血清抗MG特异性IgA和IgG的检测经ELISA 方法检测，结果表明，用rpMGA1.2 免疫的鸡群均能够产生抗pMGA1.2 抗体IgG 和IgA(图2)，在免疫后1～3 周呈稳定上升趋势，与对照组(PBS 组、Vector 组、rCTB 组)差异极显著(p<0.01)；其中rCTB 具有明显的佐剂效应，从免疫后第2 周开始，添加佐剂组与对照组抗体水平差异显著(p<0.05)，但在rCTB 佐剂作用下低剂量(10 μg)比高剂量(20 μg)rpMGA1.2 诱导产生的免疫反应更强，两组的IgG 差异显著(p<0.05)，IgA 差异不明显。

2.3 实验鸡鼻腔冲洗液和气管冲洗液中IgA的检测结果 鸡鼻洗液和气管洗液中IgA 的ELISA 检测结果显示，含rpMGA1.2 的免疫组均产生特异性IgA，其中rCTB 添加组之间差异不显著(p>0.05)，并且以低剂量组抗体增长水平最快，但均与未添加rCTB的rpMGA1.2 组差异显著(p<0.05)(图3)。

图2 血清中特异性抗体水平变化Fig.2 Titers of MG-specific antibodies in serum before and after immunization

图3 特异性sIgA 抗体水平变化Fig.3 MG-specific sIgA antibody titers in nasal and trachea washes

2.4 rp MGA1.2免疫保护作用 对照组在攻毒后第7 d 有1～2 只鸡出现轻微的呼吸道症状；第9 d 鸡群饮食量减少、渴量明显增加、呼吸有杂音、甩头甚至张口伸颈呼吸。各免疫组均未表现明显的临床症状。攻毒后第10 d 剖检实验鸡群，观察主要脏器病理变化，对气囊病理损伤情况进行分级评分(表2)。实验鸡群中表现临床症状的鸡的气管内粘液增多，气管内壁出现不同程度的出血，气囊浑浊，不同程度增厚，其中对照组的鸡病变更明显。实验组rpMGA1.2、rCTB/rpMGA1.2low和rCTB/rpMGA1.2high的气囊损伤评分平均值分别为0.67、0.33 和0.50，PBS、Vector 和rCTB 对照组的气囊损伤评分平均值分别为1.0、1.0 和0.83。根据保护率=[(对照组气囊损伤记分-免疫组气囊损伤记分)/对照组气囊损伤记分]×100%计算各组保护率。实验组rpMGA1.2、rCTB/rpMGA1.2low和rCTB/rpMGA1.2high的保护率分别为33 %、67 %和50 %。

表2 气囊病理损伤情况记分结果Table 2 The score results about the pathological injury condition of air sac

3 讨论

本实验室利用体外鸡胚气管环培养模型证明rpMGA1.2 能够竞争性结合鸡气管表面相应的MG表面蛋白结合受体，保护气管环免受HS(106ccu)损伤。这暗示尽管MG 粘附素是一大家簇，但其成员之间存在共同的结合受体，可能存在交叉保护作用，而且rpMGA1.2 竞争性结合器官粘膜表面的受体减少HS 的侵袭可能与rpMGA1.2 的免疫保护作用有关。本研究通过鼻腔接种实验鸡后进行免疫保护试验，证明rpMGA1.2 具有良好的抗原活性，不仅能诱导粘膜免疫，产生特异性IgA，而且也诱导体液免疫，产生特异性IgY，免疫鸡群获得较好的免疫保护作用。而这种免疫作用与rCTB 作为粘膜免疫的佐剂直接相关，约10 μg 剂量rpMGA1.2 诱导产生的免疫反应能提供一定的免疫保护作用，而抗原物质剂量过大对免疫应答反应却产生了部分抑制，其具体原因还有待深入研究。本研究中rCTB+rpMGA1.2 免疫鸡群对109ccu MG-HS 的攻击表现出67.3 %的保护率，其原因一方面可能与攻毒的剂量偏大有一定关系，另一方面由于实验动物群体数量较少，同时需要更合理的综合评价体系，如气管粘膜损伤评价和MG 分离，甚至病理学变化检测。当然，rpMGA1.2 作为疫苗候选免疫抗原的潜力还有待继续深入研究。

本研究结果表明pMGA1.2 是潜在的亚单位疫苗抗原，其体外重组表达产物具有良好的抗原活性，不仅能够竞争性的减少MG 侵袭鸡胚气管环，而且免疫鸡群可以获得较好的免疫保护作用。

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