鱼源嗜水气单胞菌疫苗生产菌株与分离株的抗原性分析

任 燕，张德峰，孙承文，陶家发，李宁求，刘礼辉，石存斌，吴淑勤

(中国水产科学研究院珠江水产研究所广东省水产动物免疫技术重点实验室/农业部渔药创制重点实验室，广东 广州 510380)

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是一种重要的人兽鱼共患病原，目前国内已有商品化的鱼用Ah灭活疫苗。ERIC-PCR、RAPD等分型技术从基因水平的差异来反映生物个体之间的差异，已用于Ah的分子分型[1-2]；但分子分型图谱相似的菌株可能表型特征有较大的差别，胡萌等发现商品化Ah败血症灭活疫苗生产菌株J-1与NJ-35等4株致病性菌株的ERIC-PCR图谱相似，但外膜蛋白图谱差异较大[3]。本实验利用传统血清学方法，采用western blot和细菌凝集试验，分析了J-1和近年分离的致病性菌株YYK090901的抗原性差异，为Ah流行病学调查和储备疫苗候选菌株提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株和实验动物 Ah败血症灭活疫苗(新兽药证书号：2001新兽药证字第06号)的生产菌株J-1株，由南京农业大学分离鉴定；YYK090901等27株菌株由珠江水产研究所水产病害与免疫研究室分离保存(表1)。2月龄～3月龄(体质量为1.0 kg～1.5 kg)新西兰SPF大白兔，购自广东省医学实验动物中心。

1.2 主要试剂 TSB培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；弗氏佐剂购自Sigma公司；HRP标记的羊抗兔IgG(IgG-HRP)购自Jackson公司。

1.3 兔抗全菌血清制备 培养24 h的菌液用0.3%甲醛灭活48 h～72 h，无菌检验合格后，将浓度为1.0×1010cfu/mL的全菌抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，制备油包水抗原制剂。经颈背部皮下多点注射免疫SPF级大白兔，每只免疫剂量1.5 mL。两周后与弗氏不完全佐剂等量充分乳化，加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次。耳动脉采血测定血清抗体凝集价，当凝集价达到210以上，从心脏大量采血，分别制备J-1和YYK090901菌株的阳性血清。

1.4 全菌菌体蛋白的western blot检测 分别制备28株Ah菌株的细菌悬液，每种细菌悬液的OD490nm值均为 0.6。100 μL 菌悬液中加入 25 μL 5×蛋白上样缓冲液，混合均匀，煮沸10 min。将制备的菌体蛋白样品进行SDS-PAGE，采用半干转印法转至PVDF膜，经5%脱脂奶粉的封闭液4℃封闭过夜，以抗YYK090901株或J-1株血清为一抗(1∶500)，以羊抗兔IgG-HRP为二抗(1∶3000)，通过增强型DAB底物显色液显示，并设未免疫的正常兔血清为对照，进行western blot分析。

表1 Ah分离株的来源Table 1 The sources of Ah isolates

1.5 兔抗血清凝集试验 凝集试验在U型血细胞凝集板上进行。将所有待检的灭活细菌浓度调整为6.0×108cfu/mL，取30 μL灭活细菌加到凝集板中，每孔再加入等量的2倍稀释的抗YYK090901株或J-1株血清，37℃湿盒中反应8 h～12 h，观察凝集效果。同时设阴性血清和生理盐水对照。

检测结果的判定：以“++++”表示抗原100%凝集，凝集颗粒多聚于液滴边缘，液体透明；“+++”表示75%凝集，凝集颗粒明显，液体透明；“++”表示50%凝集，液体较混浊；“+”表示有少许凝集，液体混浊；“-”表示抗原呈原有状态，无凝集。出现“++”以上的血清最大稀释度为该血清的凝集价。

2 结 果

2.1 全菌蛋白western blot检测结果 28株Ah菌株的全菌蛋白SDS-PAGE电泳后进行western blot，结果显示：抗J-1血清和抗YYK090901血清均能够识别28株菌株的全菌蛋白，但识别GYK1、G060718-2L、Ah120606L 3株菌株的蛋白条带较少，而兔阴性血清无蛋白条带识别；2种抗血清识别同一株菌的全菌蛋白条带不完全一致。表明YYK090901与J-1具有较大的抗原性差异。部分菌株的全菌蛋白western blot结果见图2、图3。

图2 抗J-1血清与部分菌株全菌蛋白western blot图谱Fig.2 Western blot profiles of the whole cell proteins of some Ah isolates against anti-J-1 serum

图3 抗YYK090901血清与部分菌株全菌蛋白western blot图谱Fig.3 Western blot profiles of the whole cell proteins of some Ah isolates against anti-YYK090901 serum

2.2 凝集试验结果 按常规抗血清凝集试验方法，将两种抗血清分别与Ah菌株在37℃湿盒中凝集反应8 h～12 h后，结果显示：抗YYK090901血清对YYK090901、Ah1206062、JX120701的凝集价均为211；对 J-1、GYK1等 16株菌的凝集价为 26～210，其中对J-1、GYK1、GYL090801的凝集价分别为27、210、29；对 N-1-2、TTF20130613L 等 9 株菌的凝集价为 24～25。抗 J-1血清对 1990s和 2012年～2013年分离的大部分菌株肯有较高的凝集价211～212， 对 GYK1、G060718-2L、FSH3、Ah080921S、CY20130414、TTF20130613L等6株菌的凝集价仅为24～25(表 2)。

表2 抗YYK090901血清和抗J-1血清对28株Ah菌株的凝集价Table 2 Agglutinating antibody titres of anti-YYK090901 serum and anti-J-1 serum to 28 isolates

3 讨 论

目前，渔业生产中细菌病的免疫防控以全菌灭活疫苗为主[4]，追踪病原流行株的抗原性的差异或针对不同血清型的菌株研制疫苗显得尤其重要。J-1株由上世纪80年代末患败血症的鲫分离[5]，为商品化Ah败血症灭活疫苗的生产菌株，2011年由广州普麟生物制品有限公司申请生产批准文号正式在市场出售。YYK090901由2009年患败血症的鳙分离，在绵羊血平板上呈β-溶血，对剑尾鱼具有很强的致病性[6]；其全菌灭活疫苗对鲫具有良好的免疫效果[7]。本研究中制备了兔抗YYK090901血清和兔抗J-1血清，western blot显示这两种血清均可以识别28株菌株的全菌蛋白部分主要条带，细菌凝集试验显示两种抗血清对大部分菌株有较高的凝集价；结果表明YYK090901、J-1的抗原性有一定差异，但均为当前流行的菌株，其疫苗仍可为鱼类提供免疫保护。抗血清对同一菌株凝集效价的高低与特异性识别全菌蛋白条带的多少没有相关性：抗YYK090901血清和抗J-1血清与对Ah120606L的凝集价较高(分别为211、28)，但均只能识别 2～3个蛋白条带；对G060718-2L的凝集价较低(均为24)，并且识别的全菌蛋白条带少；抗YYK090901血清对GYK1菌株的凝集价较高(210)，但抗J-1血清的凝集价低(24)，且2种抗血清能够识别的特异性蛋白条带少。由此推测 GYK1、Ah120606L、G060718-2L的抗原性与YYK090901、J-1差异较大，其抗原性有待进一步研究。在迟缓爱德华外膜蛋白抗原性研究中有类似的结果，即21株致病株中有20株能与Et ATCC15947株OMP抗血清反应，条带大小分别为33 ku、35 ku、38 ku、45 ku，而非致病株和另一株致病株Et122的OMP则没有反应[8]，表明同一种菌的不同分离株抗原性可能有很大的差异。GYK1为本实验室2004年从患病的鳜分离，对鳜、银鲫、剑尾鱼、小鼠均有很强的毒力[9]，其全菌灭活疫苗浸泡、注射、口服免疫鳜均有一定的免疫效果[10-11]，但与其他流行菌株的交叉保护效果有待进一步研究。

细菌外膜蛋白具有良好的抗原性[12-14]，Wang等从Ah J-1株外膜蛋白中鉴定出具有免疫原性的蛋白Omp38，western blot证明Omp38为不同血清型Ah共有的保护性抗原[15]。YYK090901株外膜蛋白的抗原性有待进一步研究。

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