基因C型鸭甲肝病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立

何美琳，张焕容,2*，程方明，杨晓农,2，岳 华,2

(1.西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学 动物医学四川省高等学校重点实验室，四川 成都 610041)

基因C 型鸭病毒性肝炎是由基因C 型鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus genotype C，DHAV-C)引起雏鸭的一种以肝脏肿大和出血为主要病理变化的急性、高度接触性和致死性的病毒性传染病[1-2]。以发病急、传播迅速、病死率高为特征，广泛分布于全世界养鸭地区，是危害养鸭业最为严重的传染病之一[3-5]。目前在我国大陆流行的主要是基因A 型和C型DHAV。两种基因型DHAV 引起雏鸭的临床症状和病理变化无法区分[6]。目前检测DHAV-C 的主要方法有RT-PCR、病毒分离鉴定、中和试验和ELISA等，其中ELISA 既可以检测抗原，也可以检测抗体，并以灵敏度高、特异性强及检测速度快等优点广泛用于免疫学检测中。

本研究利用纯化的DHAV-C 作为包被抗原，纯化的单克隆抗体(MAb)抑制血清与抗原结合，建立检测DHAV-C 特异性抗体的MAb 竞争ELISA 方法，为DHAV-C 抗体的快速检测与血清学调查提供方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株、MAb及血清 DHAV-C 临床分离株(SWUN3502)由西南民族大学动物医学实验室保存；鼠抗DHAV-C MAb 5E3-9、DHAV-C 和DHAV-A 鸭阳性血清、鸭瘟(DP)、新城疫(ND)、禽流感(AI)、大肠杆菌(E.coli)、金葡萄球菌(S.aureus)、沙门氏菌(Salmonella)、禽多杀性巴氏杆菌(P.multocida)和鸭疫里墨氏杆菌(R.anatipestifer)的阳性鸭血清以及SPF 鸭阴性血清均由西南民族大学动物医学实验室制备并保存；鸭乙型肝炎(DHBV)阳性血清和鸭圆环病毒(DUCV)阳性血清由四川农业大学贾仁勇教授馈赠。

1.2 主要试剂 HRP 标记的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TMB 购自Thermo 公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 DHAV-C MAb 5E3-9的纯化 取适量的MAb 5E3-9 小鼠腹水5 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液用蛋白A 琼脂糖亲和层析纯化，纯化的MAb进行SDS-PAGE 电泳，检测其纯度。

1.4 抗原的制备 参考文献[2]增殖和纯化DHAV-C，于DU800 核酸蛋白检测仪上测定蛋白浓度，根据测定OD280nm和OD260nm值，按公式：(mg/mL)=(1.45×OD280nm～0.74×OD260nm)×稀释倍数，计算纯化病毒的浓度。取适量纯化病毒负染后于扫描电镜观察，确定病毒的纯度及病毒粒子的形态。

1.5 抗原最佳包被量与MAb最佳稀释度的优化 采用方阵法，用包被缓冲液将纯化的DHAV-C 按20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL 稀释后包被酶标板，100 μL/孔，4 ℃过夜；洗涤后5 %脱脂奶粉37 ℃封闭2 h；洗涤后加入稀释的MAb 5E3-9，MAb 稀释度为1∶200、1∶300、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 200、1∶1 600、1∶2 400，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入羊抗鼠HRP-IgG(1∶10 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育0.5 h；洗涤后加入底物TMB 显色，室温避光孵育15 min；加入2 moL/L H2SO4终止，测定OD450nm值。OD450nm值在1.0～1.5 并且与左右相差较大的反应孔抗原浓度与MAb 稀释度即为最佳抗原包被量与MAb 最佳稀释度。

1.6 待检血清最佳稀释倍数、羊抗鼠HRP-IgG浓度及孵育时间和封闭液的优化 以最佳抗原包被浓度包被酶标板，100 μL/孔，4 ℃过夜，洗涤封闭后加入用最佳稀释度MAb 作1∶2、1∶4、1∶8、1∶10、1∶16、1∶20 倍稀释的阳性血清，并设空白对照孔、不稀释阳性血清孔、阴性血清孔及最佳稀释度MAb孔对照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入羊抗鼠HRP-IgG，37 ℃孵育0.5 h，洗涤后加入底物TMB 显色，室温避光孵育15 min；加入2 moL/L H2SO4终止，测定OD450nm值，计算抑制率。抑制率(%)=100 %×(完全MAb OD450nm值-样品OD450nm值)/完全MAb OD450nm值。同法优化羊抗鼠HRP-IgG 最佳浓度(1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000)和孵育时间(37 ℃孵育30 min、45 min、60 min、90 min)。分别用1 % BSA、2 % BSA、5 %脱脂奶粉、10 %脱脂奶粉、1 %明胶做为封闭液，经上述最佳反应条件反应，选择最佳封闭液。

1.7 临界值的确定 利用优化的竞争ELISA 方法对30 份不含有DHAV-C 抗体的鸭阴性血清经最佳稀释度MAb 稀释后进行检测，测定OD450nm值，计算抑制率，计算30 份血清的平均抑制率和标准偏差(SD)，确定临界值，临界值=阴性血清的

1.8 特异性试验 采用建立的MAb 竞争ELISA 方法对DHAV-A、DPV、DHBV、DUCV、NDV、AIV阳性鸭血清以及E.coli、S.aureus、Salmonella、P.multocida 和R.anatipestifer 的鸭阳性血清进行检测，计算上述检测血清的抑制率，分别与临界值比较，确定建立的竞争ELISA 方法是否与其他相关病原的鸭源阳性血清发生交叉反应。

1.9 灵敏性试验 将DHAV-C 阳性血清用最佳稀释度MAb 分别做1∶2～1∶256 稀释，其余条件按照优化的最佳MAb 竞争ELISA 条件进行，测定不同稀释度阳性血清MAb 竞争ELISA 检测的OD450nm值，计算抑制率，分别与临界值比较，确定建立的竞争ELISA 方法的灵敏性。

1.10 重复性试验 利用同一块酶标板中4 复孔对同1 份DHAV-C 阳性血清进行检测，测定OD450nm值，计算抑制率，比较批内变异系数；利用4 块酶标板分别对同1 份DHAV-C 阳性血清进行检测，测定OD450nm值，计算抑制率，比较批间变异系数。

1.11 符合率试验 将中和试验确定的15 份DHAV-C 阳性血清和18 份阴性血清，采用建立的竞争ELISA 方法进行检测，比较两者的符合率。

2 结果

2.1 纯化的MAb 5E3-9 将腹水上清液利用蛋白A 琼脂糖亲和层析纯化后，经SDS-PAGE 电泳检测，结果显示纯化的MAb 5E3-9 在约50 ku(IgG 重链)和25 ku(IgG 轻链)处有二条明显的条带。经测定BCA 蛋白定量结果为568 μg/mL。

2.2 纯化的DHAV-C 经氯仿去脂，蔗糖密度梯度离心纯化的DHAV-C，负染后扫描电镜观察，存在大量圆形规则的病毒粒子，直径在20 nm～40 nm，与DHAV-C 的大小相符合(图1)，核酸蛋白检测仪测定纯化的病毒蛋白浓度经计算为3.68 mg/mL。

图1 纯化的DHAV-C 电镜扫描结果Fig.1 Purified DHAV-C scanned with electronic microscope(Bar=100 nm)

2.3 MAb竞争ELISA检测方法反应条件优化结果将不同浓度DHAV-C 包被抗原与不同稀释度MAb 5E3-9 采用方阵滴定法确定最佳工作浓度，并在此基础上，进一步优化ELISA 检测条件，结果如表1所示。

表1 MAb 竞争ELISA 检测方法反应条件优化结果Table 1 Optimized conditions of the MAb competitive ELISA

2.4 临界值的确定 采用优化的MAb 竞争ELISA检测30 份鸭阴性血清，根据检测结果绘制阴性血清正态分布图(图2)，平均抑制率为28.07 %，SD 为0.026，根据公式计算阳性临界值为35.77 %，即当血清抑制率≥35.77 %者判为阳性，当血清的抑制率<35.77 %者判为阴性。

2.5 特异性试验结果 采用建立的MAb 竞争ELISA 对NDV、AIV、DHAV-A、DPV、DHBV、DUCV 鸭血清、S.aureus、E.coli、P.multocida、Salmonella 和R.anatipestifer 鸭血清进行检测，结果显示，除DHAV-C 外，对其他病原的鸭阳性血清的抑制率值均小于阳性临界值，表明建立的DHAV-C MAb 竞争ELISA 特异性良好(图3)。

图2 阴性血清正态分布图Fig.2 Normal distribution of negative serum

图3 竞争ELISA 的特异性检测Fig.3 Specific detection of competitive ELISA

2.6 灵敏性试验结果 将稀释的DHAV-C 阳性血清(1∶2～1∶256)经优化的MAb 竞争ELISA 检测，结果阳性血清稀释度为1∶128 时，抑制率为36.77 %，而阳性血清稀释度为1∶256 时，抑制率为35.12 %(表2)。表明该方法的最低检测稀释度为1∶128。

表2 灵敏性试验结果Table 2 Sensitivity detection of the MAb competitive ELISA

2.7 重复性试验结果 同一酶标板中4 复孔经批内重复试验检测，其变异系数在4.64 %～5.21 %；4块酶标板批间重复性试验变异系数在6.02%～8.68%(表3)。表明该检测方法具有良好的重复性。

表3 MAb 竞争ELISA 重复性试验(n=4)Table 3 Repeatability assay for MAb competitive ELISA(n=4)

2.8 符合率试验结果 中和试验检测阳性的15 份DHAV-C 阳性血清经建立的MAb 竞争ELISA 检测，结果均为阳性，阳性符合率为100 %(15/15)；中和试验检测的18 份DHAV-C 阴性血清经建立的MAb竞争ELISA 检测，结果阴性血清14 份，另外4 份为MAb 竞争ELISA 阳性，两种方法对阴性样品的检测符合率为77.8 %(14/18)。

3 讨论

本研究成功建立了基于DHAV-C 特异性MAb的竞争ELISA 抗体检测方法。为保证该方法的特异性，采用了纯化的DHAV-C 作为包被抗原，包被抗原的纯度越高，对于减少ELISA 的非特异性结合越明显。前期研究在纯化鸭肝炎病毒过程中利用鸭胚增殖鸭肝炎病毒，收集鸭胚尿囊液和胚体混合匀浆后采用蔗糖密度梯度法离心纯化鸭肝炎病毒，然而纯化产物通过电镜观察均含有大量的杂质[7-9]。胡燕宾等在纯化鸭肝炎病毒时加入了反复冻融以及氯仿去脂抽提的步骤，以消除在蔗糖梯度离心时脂类对病毒纯化的影响[10]。本实验综合上述病毒纯化方法，采用DHAV-C 接种SPF 鸭胚收获的尿囊液匀浆胚体组织，经反复冻融，使病毒从组织细胞中充分释放出来，然后离心收集上清液，利用氯仿抽提去上清液中的脂质，用0.22 μm 滤器再次去脂，最后采用蔗糖密度梯度离心后收集白色亮带，用PBS 溶解获得了纯化的DHAV-C，经测定病毒蛋白浓度和扫描电镜观察病毒粒子，证明纯化的DHAV-C 杂质较少，作为包被抗原降低了非特异性结合。建立ELISA 方法时，封闭液对于消除背景值具有重要的作用，本研究最终选择了含5 %脱脂乳的PBST，显著消除了非特异性结合。

国内学者采用了以蔗糖密度梯度离心法纯化的病毒作为包被抗原建立检测DHAV-A 抗体的ELISA方法，孙泉云等建立的DHAV-A 间接ELISA 抗体检测方法，只检测了与DPV 阳性血清无交叉反应，孔凤萍等建立的DHAV-A 间接ELSIA 抗体检测方法只报道了该方法对DPV、R.anatipestifer 和腺病毒等阳性血清无交叉反应，均未对所建立的方法的灵敏性进行评价[11-12]。本研究建立的以DHAV-C 特异性MAb 竞争结合待检血清的ELISA 抗体检测方法，与DHAV-C 阳性血清以外的其他10 种相关病原的鸭阳性血清均无交叉反应，该方法的特异性较好。用该方法检测经中和试验确定的阳性血清符合率，结果显示阳性符合率为100 %，阴性符合率为77.8 %。本研究首次建立了基于DHAV-C McAb 的特异、敏感的竞争ELISA 抗体检测方法，对于DHAV-C 的血清学调查和免疫或感染抗体的检测提供了新的方法。

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