QX基因型鸡传染性支气管炎病毒致弱研究

霍亚飞，许传田，崔言顺，杨少华，黄庆华，张 琳，黄艳艳，李建亮，胡北侠*，张秀美*

(1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东 济南 250100；2.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018)

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一类急性、高度接触性传染病。IBV 基因组为单股正链RNA，长约27.6 kb，基因组5' 端约2.0 kb 为复制酶基因，包含两个开放性阅读框(Opening reading frame，ORF)ORF 1a 和1b，分别编码440 ku 和300 ku 的多聚蛋白，并可以通过核糖体移码作用产生700 ku 的多聚蛋白1ab。1a 和1ab 多聚蛋白可以水解生成15 种非结构蛋白(Nonstructural proteins，nsps)，在IBV 转录与复制中发挥重要作用[1-2]。基因组3' 端编码4 种结构蛋白-纤突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、核蛋白(Nucleocapsid，N)和囊膜蛋白(Envelope，E)，此外还编码4 种非结构蛋白[1]。

目前，进行弱毒活疫苗免疫是防控该病的主要措施之一。由于不断出现IBV 变异株，对该病的有效防控造成严峻挑战。研究显示，我国近年来鸡群中分离的IBV 株50 %以上为QX 基因型，而目前广泛应用的Mass 基因型弱毒疫苗株H120 对该类流行株的免疫效果并不理想[3-6]。本实验室筛选了1 株具有广泛抗原谱的QX 基因型IBV 株SDZB0808[7]，并通过鸡胚连续传100 代进行毒力致弱(命名为P100)，初步免疫效力试验结果显示P100 对同源和异源QX基因型IBV 流行株具有良好的免疫保护效果(另文报道)。本研究对P100 进行了致病性试验和全基因组测序，并与其亲本强毒株SDZB0808 进行了序列比较，以研究IBV 致弱的主要分子机制。

1 材料和方法

1.1 病毒株、SPF鸡胚及实验动物 SDZB0808(KF853202)山东IBV 分离株由本实验室分离并保存；P100 为SDZB0808 株在9～11 日龄SPF 鸡胚连续传100 代获得的子代病毒；SPF 鸡胚和SPF 鸡购自山东省农业科学院家禽研究所SPF 鸡研究中心。

1.2 主要试剂 TRIzol Reagent RNA 抽提试剂、One-Step RT-PCR 试剂盒和DNA Marker DL 2000 均购自山东赛恩斯科技有限公司。

1.3 引物设计与合成 参考GenBank 中登录的IBV全基因组序列，设计25 对引物用于扩增P100 全基因组(表略)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 P100致病性试验

1.4.1 实验鸡分组 3 日龄SPF 鸡60 只，随机分成3 组，分别编号为A、B 和C 组，每组20 只。A、B 组分别采用P100 和SDZB0808 进行滴鼻点眼病毒接种，剂量均为105.0EID50/只。C 组用0.01 mL 无菌0.01 M(pH7.2)PBS 缓冲液滴鼻点眼。各组实验鸡分别于不同隔离器中饲养。每天观察实验鸡精神、食欲情况(14 d)，统计发病死亡情况，病死鸡进行剖检。

1.4.2 实验鸡病毒接种后排毒检测 于病毒接种后第4 d、7 d、10 d 及14 d 迫杀各组实验鸡各3 只，观察病理变化，将气管和肾脏置于10 %福尔马林中，以备制作组织切片，同时取气管、肺脏、肾脏、法氏囊、腺胃、脾脏、肝脏、心脏、喉头和泄殖腔棉拭进行病毒RT-PCR 检测，每次3 只。

1.5 P100全基因组序列测定与分析 按TRIzol 试剂盒说明方法提取病毒基因组RNA，反转录制备cDNA。利用通用引物PCR 扩增后经1.2 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。将鉴定正确的cDNA 由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。采用分子生物学软件DNAStar 将P100 各基因片段序列进行拼接，获得其全基因序列，并与SDZB0808 基因组进行比对分析。

2 结果

2.1 P100致病性试验结果

2.1.1 实验鸡临床症状和病理变化 B 组经SDZB0808 攻毒后2 d 个别鸡只出现食欲下降，精神沉郁、缩颈、羽毛松乱和气管啰音等临床症状，于3 d～10 d 病死8 只，第14 d 存活实验鸡精神、食欲基本恢复正常。剖检显示病死鸡主要表现气管环出血、肾脏肿大(花斑肾)。A 组实验鸡经P100 攻毒后在14 d 观察期内精神、食欲均正常，与对照组(C组)相比无明显临床症状和病理变化。

2.1.2 实验鸡病毒接种后排毒检测 于病毒接种后不同时间点对实验鸡喉头和泄殖腔样品进行检测，结果显示，A、B 组实验鸡喉头和泄殖腔样品在攻毒后4 d～14 d 均可以检测到病毒，正常对照组检测结果均为阴性(表1)。

内脏组织病毒检测结果显示：A 组实验鸡经P100 攻毒后4 d～14 d 气管和法氏囊组织均可以检测到病毒，肺脏(4 d 和14 d)、腺胃(4 d)和脾脏(7 d和10 d)仅在个别时间点检测到病毒，肾脏、肝脏和心脏在4 d～14 d 病毒检测均为阴性。B 组实验鸡经SDZB0808 攻毒后，气管、肺脏和肾脏等组织在第4 d～14 d 均可以检测到病毒(表1)，病毒检出率和存在时间均明显高于A 组。对照组(C 组)实验鸡组织排毒检测均为阴性。

病理组织观察结果显示：A 组实验鸡气管和肾脏无明显的组织病变，B 组实验鸡气管纤毛脱落，出血；肾脏肿大，间质内炎性细胞浸润(图1)。

表1 实验鸡攻毒后喉头、泄殖腔棉拭和内脏组织病毒检测结果Table 1 Virus detection from swabs and tissues of chickens inoculated with P100 and SDZB0808

图1 实验鸡接种后7 d 气管和肾脏组织病理组织学变化(苏木精-伊红染色，1 000×)Fig.1 Gross lesions and histopathologic analysis(hematoxylin and eosin staining,1,000×)of tissues from chickens infected with P100 or SDZB0808

2.2 P100全基因组测序结果 将P100 各基因片段测序结果进行拼接，获得了其除5' 端Cap 和3' 端Poly(A)之外的基因组序列(27 647 bp)，并登录至GenBank，序列号为KM586818。

与亲本株SDZB0808 进行全基因组序列比对分析显示，P100 共有3 个位点发生有义碱基突变(A9664C、A20596T 和C24300A)，导致ORF 1a(I3047L)、S蛋白(N76Y)和E 蛋白(L29I)氨基酸发生了替换(表2)。

表2 致弱前后不同位点的变化Table 2 Changes of different bases in SDZB0808 and P100

P100 基因组在3 244～3 277 缺失了30 个核苷酸，导致ORF 1a 缺失了10 个氨基酸(906VKESV EKPTG915)。对不同代次进行ORF 1a 序列比对：55代之前序列未发生变化，之后出现个别位点的变化，在第62 代开始出现30 bp 碱基全部缺失(图2)。

图2 不同代次ORF 1a 序列变化情况Fig.1 Gene sequence of ORF 1a in different passage

3 讨论

IB 弱毒苗是由IBV 分离株在鸡胚连续传代获得的，H120、MA5 和2886 等多种IB 弱毒活疫苗用于该病的免疫预防，但这种由强毒变为弱毒的致弱机理目前尚未明确。本研究中致病性试验结果表明：P100 主要在SPF 鸡气管和法氏囊组织内复制，在肺脏、腺胃和脾脏内增殖时间较短，在肾脏、肝脏和心脏组织内不能够增殖。与SDZB0808 株相比，P100 在SPF 鸡体内的组织分布较少，特别是其失去了在鸡肾脏组织内的复制能力，这可能是导致IBV毒力下降的主要因素之一。

Phillips 等对多株IBV 与其致弱后病毒基因组进行序列比对分析，结果显示37.08 %～43.66 %的氨基酸替换发生在病毒基因组5' 端非结构蛋白nsp3上，并且这一区域还有8～10 个氨基酸缺失，因此认为IBV 非结构蛋白nsp3 的氨基酸变化与病毒致弱有关[8]。在本研究中，P100 与其亲本强毒株SDZB 0808 相比在基因组3 244～3 273 位缺失30 个核苷酸，导致其ORF 1a 缺失10 个氨基酸(906VKESVEK PTG915)，缺失位点也位于nsp3 蛋白上。此外，P100在第9 664 位的碱基突变导致ORF 1a I3047L 氨基酸替换。由于ORF 1a 编码的多聚蛋白可以水解成多个功能性蛋白，参与IBV 的复制，其氨基酸的突变或缺失可能影响IBV 在宿主细胞内的复制。

在3'端结构蛋白和非结构蛋白基因中，P100 与SDZB0808 在S 蛋白(N76Y)和E 蛋白(L29I)发生了氨基酸替换。S 蛋白与IBV 的组织嗜性密切相关[9]，E蛋白与M 蛋白协同作用，在病毒装配和出芽中发挥重要作用[10-11]，因此这两个蛋白的氨基酸序列变化也可能与病毒的致弱有关。Wang 等对某病毒株及其致弱株的3' 端7.3 kb 基因进行测序显示：S1 蛋白、S2 蛋白和M 蛋白的氨基酸序列出现变化，而N 蛋白部分未发生变化[12]；Geerligs 对某病毒株及其致弱株的S1 蛋白高变区进行测序，结果显示，1 424 个核苷酸中有4 个位点发生变化，2 个氨基酸发生突变[13]。本研究发生的氨基酸残基变异位点与之前研究均不一致，推测病毒株致弱可能是多途径的，不同病毒株的致弱过程并不一样。

本研究结果表明QX 基因型IBV 分离株SDZB0808 毒力致弱与其基因组多个位点的基因突变和缺失有关，对这些关键位点进行功能验证对于阐明IBV 的致病机制和疫苗研发均具有重要的理论指导意义。

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