中国首株H13N6亚型禽流感病毒遗传进化分析及致病性和传播性评估

高晓龙，范胜涛，李胜楠，国 娇，王爱荣，孙伟洋，李 雪，虞一聪，王铁成，李元果，桑晓宇，于志君，张 坤，高玉伟，夏咸柱*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130062)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于正粘病毒科，为单股负链RNA 病毒，其基因组包括8个片段分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，至少编码11 种蛋白质[1]。根据其表面蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)，AIVs 可分为16 个HA 亚型和9 个NA 亚型[2]。AIVs 可以感染包括人、猪、马、貂、海洋哺乳动物、家禽和野生鸟类在内的多种动物。目前为止，禽流感病毒所有亚型(H1～H16，N1～N9)均在野鸟中分离得到，因此野生鸟类尤其是雁形目(鸭、鹅)和鸻形目(鸥类、水鸟)为AIVs 的自然宿主[3]。

自从1977 年从美国沿海地区鸥类粪便中分离到第1 株H13 亚型AIV[4]，之后有关H13 亚型AIVs 分离的报道较少，这主要与H13 AIVs 的宿主特异性有关，其宿主为鸥类和鸭类等水禽，其他禽类中从未检测到。2013 年秋季，从大连庄河地区采集的野鸭粪便样品中首次分离到国内H13N6 亚型低致病性AIV，并对其核苷酸序列同源性以及致病力和传播能力等生物学特性进行分析。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要实验材料 病毒分离株A/mallard/Dalian/DZ-137/2013(H13N6)由本实验室分离保存；SPF 鸡胚和豚鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司；SPF 鸡购自北京梅里亚实验动物技术有限公司；BALB/c 小鼠购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

1.2 主要试剂 病毒RNA 提取试剂盒购自BioFlux公司；AMV 反转录试剂盒购自Promega 公司；高保真DNA 聚合酶购自全式金公司。

1.3 病毒的增殖及鸡胚半数感染量(EID50)测定 将AIV 分离株经有限稀释后采用9 日龄SPF 鸡胚纯化3 代，进行病毒增殖。增殖后的H13N6 亚型AIV 按10 倍倍比稀释，每个稀释度接种3 个SPF 鸡胚，每个鸡胚接种100 μL，37 ℃培养48 h 后，收取尿囊液测其血凝性，根据Reed-Muench 方法计算EID50。

1.4 病毒的分离鉴定 将样品接种9 日龄SPF 鸡胚，37 ℃孵化72 h，取尿囊液进行血凝试验，取200 μL 具有血凝性的病毒尿囊液，按照RNA 提取试剂盒使用说明书提取病毒RNA，然后按照AMV反转录试剂盒使用说明进行反转录，制备cDNA。PCR 方法鉴定AIV，参照农业部标准NY/T 772-2004 AIV 通用引物：(1)M-F：TTCTAACCGAGGTCGA AAC；M-R：AAGCGT CTACGCTGCAGTCC，扩增目的片段大小为229 bp；(2)NP-F：CAGRTACTGG GCHATAAGRAC；NP-R：GCATTGTCTCCGAAGA AATAAG，扩增目的片段大小为330 bp。根据Kenji Tsukamoto 等设计的分型引物对AIV 分离株进行分型[5]。

1.5 AIV亚型全序列测序分析 根据GenBank 中H13N6 亚型AIV 各基因片段同源性最高的序列设计PCR 引物，对该分离株进行全序列扩增，并送由吉林省库美生物科技有限公司测序。利用DNAStar 软件包中SeqMan 软件对所测定的H13N6 分离株全基因序列进行拼接；采用MEGA6.0 软件中Neighborjoining 方法构建基因序列系统进化树，Bootstrap 值设定为1 000。

统计截止到2011 年提交到全球流感共享数据库(the Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，GISAID)的H13 亚型AIVs 分布地区以及宿主信息。

1.6 小鼠、豚鼠以及SPF鸡致病性分析

1.6.1 小鼠致病性试验 选取9 只8 周龄雌性BALB/c 小鼠乙醚麻醉后，每只小鼠鼻腔接种106EID50/100 μL 病毒稀释液50 μL，每隔24 h 记录小鼠体重变化，并于攻毒后3 d、5 d 分别迫杀3 只小鼠，取其脑、鼻甲骨、肺等组织样品，测其病毒滴度，攻毒后14 d 采集血清，测其抗体水平。

1.6.2 豚鼠传播试验 选取6 只雌性体质量300 g～350 g SPF 级豚鼠分组试验，其中3 只豚鼠为接种组，每只豚鼠每个鼻孔接种106EID50/300 μL 的病毒稀释液150 μL，24 h 后将接触组3 只豚鼠与接种组豚鼠同笼，分别于接种后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d采集豚鼠鼻洗液1 mL，测其病毒滴度。

1.6.3 SPF 鸡致病性试验 按每只鸡106EID50/100 μL病毒经鼻腔感染接种组8 只6 周龄SPF 鸡，24 h 后将另外2 只SPF 鸡与接种组同笼。攻毒后第3 d 迫杀2 只接种组鸡，取其脑、心、肺、气管、肺、肝、胃、十二指肠、肾、盲肠扁桃体等组织样品；并且分别采集接种后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d 泄殖腔和喉头拭子样品，并将其接种鸡胚进行病毒滴定。

2 结果

2.1 AIV鉴定及序列分析 该分离株病毒经PCR鉴定为H13N6 亚型AIV。序列分析显示，H13N6 亚型AIV 分离株HA 基因核苷酸编码区为1 701 bp，编码567 个氨基酸，与A/duck/Hokkaido/WZ68/2012(H13N2)核苷酸同源性为97 %，碱性裂解位点区序列为PAISNR↓G 含有1 个碱性裂解位点，具有低致病性AIV 典型特征，含有8 个潜在糖基化位点，并且其226 位点(H3 numbering)为Q，表明该病毒具有禽样受体结合特性分子标记；NA 核苷酸编码区为1 413 bp，编码471 个氨基酸，与A/glaucouswinged gull/Southeastern Alaska/9JR0822R0/2009(H13N6)核苷酸同源性为96%，茎部未发现氨基酸缺失(表1)。

2.2 遗传进化及统计分析 该分离株NA 基因属于北美谱系，其余7 个基因片段均属于欧亚谱系；其中NA、PB2、PB1、PA 基因可能来源于野鸭，而HA、NP、M、NS 基因可能来源于鸥类(图1，图2，表2)。

统计分析GISAIP 的H13 亚型AIV 数据显示，1985 年～1996 年H13 亚型AIVs 分离数量少，但呈增长趋势，而且除大洋洲和南极洲以外呈全球分布，分离宿主80 %为鸥类，其次8 %病毒株分离自水鸟，雁鸭类和水鸟各占5 %。鲸鱼样本分离株仅占2 %，尚未从除鲸鱼以外的哺乳动物和陆生家禽中分离到该亚型(图3)。

表1 H13N6 AIV 分子特性分析Table 1 Molecular analysis of H13N6 AIV

图1 H13N6 亚型AIV HA 基因遗传进化树Fig.1 Phylogenetic tree of HA gene of H13N6

图2 H13N6 亚型AIV NA 基因遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of NA gene of H13N6

表2 H13N6 亚型AIV 谱系分析Table 2 Lineage analysis of H13N6

图3 1977 年～2011 年各地区H13 亚型AIV 分离数量及宿主分布Fig.3 The amount of the H13 AIVs in different areas from 1977-2011 and the host of the H13 AIVs are shown

2.3 病毒对小鼠、豚鼠、鸡的感染性试验 H13N6 AIV 分离株接种BALB/c 小鼠后未观察到精神不振、弓背、竖毛、体重下降等明显临床症状，并且其脑、肺、鼻甲骨等组织未检测到病毒，但均检测到较低抗体水平(抗体滴度1∶10)；感染豚鼠后，均未从接种组和接触组鼻洗液中检测到病毒；感染SPF鸡后均无明显临床症状，虽未从感染鸡和同居鸡喉头拭子和泄殖腔拭子检测到病毒，但攻毒后14 d 其中2 只接种鸡有较低抗体水平(抗体滴度1∶20)，接触组鸡血清未检测到H13N6 抗体。感染鸡脑、气管、肺、心脏、肝、肾、胃、十二指肠、盲肠扁桃体等脏器中同样也未检测到该病毒。

3 讨论

本研究分离到的H13N6 亚型AIV 系我国首次分离得到，序列分析表明其HA 蛋白的186 位点为缬氨酸(V)[6]、226 位点为谷氨酰胺(Q)、228 位点为丝氨酸(S)，由于H13 亚型AIVs HA 蛋白228 位自然存在的为丝氨酸，所以其受体结合特性不会发生改变，仍然只能结合禽SAa-2,3Gal 受体；NA 茎部缺失具有改变宿主嗜性、增强病毒复制的能力[7]，该分离株NA 茎部未发现缺失；PB2 蛋白627 和701位点均未发生E627K、D701N[8]突变表明其尚未获得感染哺乳动物的能力，与小鼠致病性试验结果一致。1977 年～2011 年全球分离H13 亚型AIVs 毒株统计结果表明，H13 亚型分离株均分离于野生水禽、鲸以及环境样本，未从陆生家禽中分离到该亚型AIV。以上分析表明H13N6 分离株尚未获得由野生水禽向陆生家禽和哺乳动物进行跨种传播的能力，虽然其能够感染鸡，但其不能在鸡体内进行有效复制，并且不能通过呼吸道和消化道排毒。

候鸟在全球有8 条主要迁徙路线，其中有3 条经过我国，因此候鸟在我国AIVs 传播过程中发挥重要的作用[9]。随着H13 亚型AIVs 在全球不同地区野生水禽中感染数量不断增加，由最初的欧亚和北美地区逐步向南美和非洲地区传播。欧亚谱系和北美谱系不同AIVs 之间能通过野生水鸟迁徙进行跨洲际传播，继而引起AIVs 不同谱系间发生重组。辽宁省大连地区位于东亚-澳大利亚路线迁徙路线内，同时该地区也是北美地区和欧亚地区候鸟繁殖地，为病毒传入该地区和不同地区间病毒重组创造了有利条件。我国首例H13N6 亚型AIV 株的分离表明，野生鸟类在AIV 跨洲际和种间传播中发挥了重要作用，因此应该加强野生鸟类中AIVs 的监测和流行病学调查。

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