猪囊尾蚴和华支睾吸虫液相基因芯片检测方法的建立

刘 畅，路义鑫，杨朋欣，李晓云，王 泽，汪 洋，宋铭忻

(东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

猪囊尾蚴(Cysticercus cellulose)和华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)可以感染人和动物导致囊尾蚴病和华支睾吸虫病[1]。脑囊尾蚴病是因中枢神经系统感染囊虫而呈现出不同的临床症状，包括癫痫症和脑积水[2]；华支睾吸虫病最常见表现为肝吸虫病，严重者甚至发展为胆管癌[3]。最新寄生虫血清流行病学调查显示，中国大陆猪囊尾蚴和华支睾吸虫人群感染率分别为0.58 %和0.55 %[4]。由于现代人饮食来源和方式的多样化，猪囊尾蚴和华支睾吸虫等感染引起的食源性寄生虫病造成的食品安全问题愈发突出，并且成混合感染趋势[4-5]。因此，加强寄生虫猪囊尾蚴和华支睾吸虫的检测尤为重要。

目前，寄生虫的检测方法主要是基于PCR 方法的分子生物学检测手段，包括多重PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增技术、PCR-RFLP 技术等[6-10]。液相基因芯片技术是近年来出现的一种结合Luminex xMAP(液相芯片)系统与多重PCR 技术的新型检测手段，可以满足高通量多指标同步、迅速和高效的检测微生物的要求[11-12]。国内鲜有关于液相基因芯片寄生虫检测的报道[13-14]，而同时检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫两种虫体仍无相关报道。本研究以猪囊尾蚴ITS 基因和华支睾吸虫ITS 基因为靶序列，设计并合成特异性探针和引物，扩增目的片段并构建阳性重组质粒标准品，建立一种基于双重PCR 的高效、灵敏和特异的液相基因芯片检测方法。

1 材料和方法

1.1 虫 株 猪囊尾蚴由兰州兽医研究所惠赠，为吉林省长春株；华支睾吸虫由黑龙江八一农垦大学寄生虫教研室惠赠，为黑龙江省肇源株；弓形虫(T.gondii)由兰州兽医研究所惠赠，为GLS 株；猪旋毛虫(T.spiralis)由东北农业大学寄生虫教研室保种，为黑龙江省五常株。

1.2 主要试剂及仪器 链霉素-亲和素-藻红蛋白(SAPE)、表面羧基化的荧光编码微球购自上海透景生物科技有限公司；Luminex100液体悬浮点阵检测仪为美国Luminex 公司产品。

1.3 探针及引物的设计与合成 根据GenBank 登录的猪囊尾蚴ITS1(EU747668)和华支睾吸虫ITS1(EU038112)基因序列，分别选择保守区域应用DNA Star、Primer5.0 和Oligo6.0 软件设计探针和引物(表1)。探针5'端均添加poly TⅡ尾并氨基化，同时将两条用于杂交的生物素标记的探针互补链作为阳性对照，上游引物5'端均采用生物素标记。探针和引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 探针和引物序列Table 1 The sequences of the probes and primers

1.4 重组质粒标准品的制备 分别以猪囊尾蚴和华支睾吸虫基因组DNA 为模板，进行PCR 扩增，同时设置阴性对照，反应条件为：95 ℃5 min；94 ℃30 s、57.5 ℃/59 ℃30 s、72 ℃45 s，共30 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后分别克隆于pMD18-T 载体中，测序鉴定。测定阳性重组质粒浓度，根据公式换算成质粒拷贝数，作为重组质粒标准品，将其进行2 倍倍比稀释(20～2-11)。

1.5 双重PCR扩增 以两种虫体混合基因组DNA为模板，进行双重PCR 扩增。反应条件为：95 ℃5 min；94 ℃30 s、59 ℃30 s、72 ℃45 s，30 个循环；72 ℃8 min。PCR 产物经6 % SDS-PAGE 电泳分离，银染，拍照。

1.6 液相基因芯片检测体系建立

1.6.1 探针与微球的偶联 将猪囊尾蚴和华支睾吸虫ITS1 基因探针分别与表面带有活性羧基化基团编号为44 和56 号的微球偶联，命名为Ⅰ和Ⅱ，整个偶联过程由上海透景生物科技有限公司完成，并采用生物素标记的探针互补链分别测定偶联率。

1.6.2 探针偶联的验证 分别取单项和双重PCR 产物各3 μL，加入7 μL TE 溶液和20 μL 稀释的微球溶液，95 ℃变性5 min，50 ℃孵育20 min，加入80 μL 显色液，50 ℃孵育20 min，于Luminex100液体悬浮点阵检测仪读取各微球检测的荧光强度值。

1.6.3 液相基因芯片结果判定标准 理论上只有当探针与相应的DNA 模板特异性结合时才会产生荧光信号，数据结果采用平均荧光强度(Median Fluorescence Intensity，MFI)表示。信噪比SR=MFI(目标产物)/MFI(空白背景)，当SR≥3，并且满足MFI(目标产物)>100，即判定目标产物为阳性[10]。

1.7 特异性试验 采用建立的双重PCR 方法分别扩增弓形虫、旋毛虫、猪囊尾蚴、华支睾吸虫的基因组DNA 以及猪囊尾蚴和华支睾吸虫的混合基因组DNA，应用液相基因芯片体系检测各基因组PCR 产物的荧光强度，并对结果进行分析，验证该方法的特异性。

1.8 敏感性试验 对猪囊尾蚴和华支睾吸虫ITS1基因阳性重组质粒标准品进行2-n倍比稀释，各稀释12 个梯度(20～2-11)，经PCR 扩增，分别应用液相基因芯片体系和琼脂糖凝胶电泳检测，比较两者的敏感性。

1.9 重复性试验 采用PCR 方法分别扩增猪囊尾蚴和华支睾吸虫的基因组DNA，以液相基因芯片体系检测相应PCR 产物荧光强度，在相同试验条件下重复6 次，并对结果进行分析，验证该方法的重复性。

1.10 人工模拟样品检测试验 分别提取猪囊尾蚴、华支睾吸虫和检疫合格猪肌肉组织的基因组DNA，将各基因组DNA 分装至30 个EP 管中：其中20 个管加入一种虫体基因组DNA；8 个管加入两种虫体的混合基因组DNA；另外2 个管为对照组。将30 个EP 管随机编号，应用建立的液相基因芯片方法分别扩增，对结果进行分析。

2 结果

2.1 目的基因的扩增与重组质粒标准品的制备 分别以猪囊尾蚴和华支睾吸虫基因组DNA 为模板，采用PCR 扩增得到大小约为150 bp 和170 bp 的目的片段(图1)，与预期相符。将其分别克隆于pMD18-T 中构建重组质粒标准品，测序结果表明，猪囊尾蚴和华支睾吸虫ITS1 基因与GenBank 登录的相应基因片段相似性分别为99.35 %和98.27 %。

图1 目的基因PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification of C.cellulose and C.sinensis

2.2 双重PCR扩增产物银染结果 以猪囊尾蚴和华支睾吸虫混合基因组DNA 为模板，进行双重PCR 扩增，经6 % SDS-PAGE 电泳分离，银染结果显示，目的片段与预期大小相符，并且其结果与单项PCR 一致(图2)。

图2 双重PCR 扩增结果Fig.2 Optimization test of duplex PCR

2.3 液相基因芯片体系建立 应用生物素标记的探针互补链测定液相基因芯片Ⅰ和Ⅱ，两虫体SR 分别为124.3 和189.05，表明检测偶联率较高，探针可以特异性的结合到微球上，液相基因芯片Ⅰ和Ⅱ可以用于该检测体系。液相基因芯片体系检测单项PCR 和双重PCR 产物结果表明：阴性和阳性的荧光强度检测值与琼脂糖凝胶电泳结果一致(图略)，目的产物SR 信噪比高，可视为阳性结果，双重PCR产物检测结果与单重PCR 产物检测结果一致(表2)。

2.4 特异性试验 分别应用建立的液相基因芯片体系Ⅰ和Ⅱ检测弓形虫、旋毛虫、猪囊尾蚴、华支睾吸虫PCR 产物以及猪囊尾蚴和华支睾吸虫混合PCR产物的荧光强度。根据该检测体系的判定标准，结果显示，扩增猪囊尾蚴、华支睾吸虫及二者混合DNA 的检测结果为阳性，而扩增弓形虫和旋毛虫DNA 的结果为阴性，表明该方法具有较好的特异性(表3)。

表2 液相基因芯片检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫Table 2 C.cellulose and C.sinensis detected by liquid gene chip

表3 液相基因芯片特异性检测Table 3 Specificity tests of liquid gene chip

2.5 敏感性试验 以猪囊尾蚴和华支睾吸虫12 个梯度稀释的阳性重组质粒为模板进行PCR 扩增，PCR 产物通过液相基因芯片体系检测和琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，前者检测两虫体的最低检出浓度均可达到原液的2-9，灵敏度分别为5.13×104拷贝/μL 和2.03×104拷贝/μL(图3)；后者检测两虫体的最低检出浓度为原液的2-6和2-5，灵敏度分别为4.11×105拷贝/μL 和1.63×105拷贝/μL(图4)，液相基因芯片体系的灵敏度约为琼脂糖凝胶电泳的8 倍。

2.6 重复性检测 在相同试验条件下，液相基因芯片体系重复检测样品6 次，计算各批间的MFI 及变异系数(CV)。结果显示各变异系数均在8 %以内(表4)，表明重复性和稳定性良好。

2.7 人工模拟样品检测试验结果 应用液相基因芯片体系检测待检样品，30 份样品中阳性率和阴性率分别为90%(27/30)和7%(2/30)，检出率分别为96%和100 %，盲测与预期的结果基本相符，准确率达98 %，表明该方法在实际操作中具有一定的可行性。

图3 液相基因芯片检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的敏感性结果Fig.3 Sensitivity tests of C.cellulose and C.sinensi by liquid gene chip

图4 琼脂凝胶检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫敏感性结果Fig.4 Sensitivity test of C.cellulose and C.sinensis by agarose gel

表4 液相基因芯片体系重复性检测Table 4 Reproducibility test of liquid gene chip

3 讨论

近年来，关于寄生虫的分子生物学检测方法发展迅速。本研究建立在Luminex xMAP(液相芯片)系统与双重PCR 技术的基础上，形成的液相基因芯片体系充分结合两种技术的优点，可以实现同时对猪囊尾蚴和华支睾吸虫的检测。结果显示该方法特异性强、灵敏性高、重复性好，其灵敏度分别高达5.13×104拷贝/μL 和2.03×104拷贝/μL，这与张媛和杨朋欣建立的液相芯片技术对旋毛虫和弓形虫等的检测灵敏度属于同一数量级[13-14]。与传统的寄生虫检测和监测技术如病原学检测技术(目检法、压片镜检法、组织学诊断法)，免疫学检测技术(间接血凝试验、ELISA、双抗体夹心)相比，该技术更具优势。

正确选择靶基因和设计探针对液相基因芯片检测体系的建立至关重要。大多数生物体中，核糖体基因的一级结构高度保守和重复，作为重复单位的特殊组成部分ITS1，被广泛应用于寄生虫的分类、鉴定和系统发育等研究[15-16]。本研究建立的液相基因芯片技术能够特异地对猪囊尾蚴和华支睾吸虫PCR 产物进行检测，灵敏性检测结果显示MFI 值随着PCR 产物浓度减少，呈先升高后下降的趋势，该现象未见有相关文献报道，推测可能是体系所限，液相基因芯片对PCR 产物浓度也有最适浓度。因所用虫体均为人兽共患寄生虫，考虑到安全性和可行性等因素，本研究采用人工模拟污染样品试验，虽然其盲测结果相对准确可靠，但在临床样品的检测应用有待下一步验证。总之，本研究建立的液相基因芯片技术不仅为寄生虫的检验检疫和卫生监督提供一项新技术，也为未来这项技术在科学研究、临床检测、疾病的预防及早期诊断中的广泛应用提供实验依据。

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