抗Ⅰ型鸭肝炎病毒RdRp蛋白噬菌体单链抗体库构建及单链抗体的淘选

王永娟，李碧春，沈明君，洪伟鸣，左伟勇*

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300)

鸭病毒性肝炎主要由1 型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1，DHV-1)引起。目前其防制以疫苗免疫为主，但由于病毒株的变异大大降低了免疫效果，因此亟待开展防制新方法的研究。DHV-1 全基因组序列于2006 年首次报道[1]，Tseng 等测定的DHV-1 全基因组序列约为7 690 nt 的单股正链RNA，编码2 249 个氨基酸，编码蛋白的顺序为5'-UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3'[2]。3D 蛋白是RNA 依赖的RNA 聚合酶(RdRp)，它能够特异地识别病毒RNA，参与选择RNA 模板和RNA 合成的起始位点、维持RNA 合成的延伸、协调RNA 合成步骤和调控病毒变异进化，对于RNA 的复制至关重要[3]。

单链抗体即单链抗体可变区片段(Single-chain antibody variable fragment，ScFv)是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段10～25 个氨基酸的连接肽(Linker)连接而成的抗原特异性结合的最小功能结构单位[4]。由于scFv 具有易于构建和表达、分子质量小、穿透力强、特异性好、免疫原性低的优点[5]，是目前报道最多的一种基因工程抗体，在抑制病毒复制(如HIV-1)、肿瘤基因治疗、基因敲除、药物残留检测等方面得到了广泛应用[6-9]。本研究构建了抗DHV-1 RdRp 蛋白的scFv 基因文库，并淘选获得特异性结合RdRp 的scFv，对于鸭病毒性肝炎防制新策略研究具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 DHV-1 SH 株由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠；pET-32a 载体、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)和DH5α 均由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、Taq DNA 聚合酶、1 kb DNA Ladder、Ex-Taq MasterMix 和RNase Inhibitor 购自Fermentas 公司；Wizard DNA Clean-up System 购自Promega 公司；pCANTAB5E、M13K07、E.coli TG1、HB2151 和TRIzol 试剂购自Invitrogen 公司；HRP 标记的抗M13 抗体购自GE Healthcare 公司、抗E-tag 的单克隆抗体(MAb)购自Abcam 公司；6 周龄ICR 小鼠购自扬州大学比较医学中心。

1.2 引物及Linker设计 根据GenBank 中登录的DHV-1 SH 株基因序列(HQ265433)设计扩增RdRp 核苷酸序列(3D)的特异性引物。引物序列为3DF：5'-GGAAGATCTATGGGGAAAGTAGTGAGTAAG C-3'(Bgl Ⅱ)/3DR：5'-CGGTCGACGATCATCATGCA AGCTGTGTATG-3'(SalⅠ)。

参照文献[10]设计鼠源抗体重链及轻链可变区的扩增引物，连接肽Linker 采用文献[11]介绍的(Gly4Ser)3形式，两端根据重链及轻链的序列分别添加互补序列。所有序列均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.3 DHV-ⅠRdRp的克隆及表达 按照TRIzol 说明书提取含DHV-1 的鸡胚总RNA，反转录制备cDNA，以其为模板，扩增RdRp 基因，胶回收后经BglⅡ/SalⅠ双酶切，克隆于pET-32a 中，构建重组表达质粒pET-RdRp。将pET-RdRp 转化BL21(DE3)感受态，重组菌经1 mmol/L 的IPTG 诱导表达，超声裂解，收获上清液和沉淀分别于12 % SDS-PAGE胶中检测分析。

1 M KCL 染色SDS-PAGE 电泳后的重组蛋白，切下明显的乳白色蛋白条带，使用凝胶成像系统的定量软件对其进行定量，液氮法碾磨碎至1 mL 注射器针头可以吸出为止，-80 ℃保存备用。

1.4 动物免疫及脾脏总RNA提取 按每只小鼠100 μg 的剂量颈背部皮下注射6 周龄ICR 小鼠，免疫程序为每2 周一次，3 免后采血分离血清，测定抗体效价；加强免疫后3 d 采集其脾脏，按TRIzol说明书方法提取0.1 g 脾脏总RNA，取少量用紫外分光光度仪测定其纯度和浓度。

1.5 全长sc Fv基因的制备 参考文献[9]方法，利用随机引物将提取的RNA(>1 μg)反转录制备cDNA，再以VH基因上下游引物(VH-B/VH-F)和VL基因上下游引物(VL-B/VL-F1、2、3、4)扩增全套VH基因和VL基因，通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)扩增Linker-VL片段，并进一步扩增VH-Linker-VL片段(即全长scFv 编码序列)。

1.6 sc Fv库的构建及鉴定 采用SfiⅠ/NotⅠ双酶切全长scFv 基因并克隆于pCANTAB5E 载体中，转化感受态TG1，取100 μL 转化菌涂布2×YT-GA 平板，37 ℃过夜培养，计算单菌落数，推算库容；随机挑取12 个单菌落，提取重组质粒进行酶切鉴定。

其余转化菌加入1 mL 2×YT-G，37 ℃振荡培养至OD600nm为0.8，加入终浓度1010pfu/mL M13K07辅助噬菌体，继续培养30 min 后加终浓度100 μg/mL的氨苄青霉素，继续培养1 h 后离心弃上清液，将沉淀重悬于100 mL 2×YT-AK 培养基，振荡过夜后，4 ℃高速离心，收集上清液，加入1/5 体积的PEG/NaCl 溶液，冰浴1 h 后4 ℃高速离心弃上清液，2×YT 重悬沉淀，得到单链噬菌体抗体初级库，用于单链噬菌体抗体库的富集筛选。

1.7 噬菌体滴度测定 将上述噬菌体液10-6～10-10稀释，分别取100 μL 加入OD600nm值为1 的500 μL TG1 菌液中，37 ℃水浴静置30 min，加入4 mL 2×YT 半固体培养基，混匀后立即转入2×YT 固体培养基，37 ℃培养过夜，根据空斑数(pfu)计算噬菌体滴度。

1.8 scFv的富集淘选 参考文献[12]方法，选择微孔板法借助抗原抗体特异性结合及噬菌体侵染扩增进行富集筛选：将所得初级噬菌体抗体库加入至纯化的RdRp 原核表达产物包被的96 孔板中，37 ℃水浴静置1 h，PBS 洗涤，加入500 μL 100 mmol/L Gly-HCL 洗脱，10 min 后加入50 μL 1 mol/L Tris(pH8.5)，收集上清液，0.22 μm 滤器过滤除菌，加入9 倍体积的对数生长期TG1，培养后取10 μL 涂布2×YT-GA 平板，37 ℃过夜培养，计算单菌落数，推算库容；其余的再次加入M13KO7 辅助噬菌体感染，构建单链二级噬菌体抗体库。重复上述富集程序4 次。

1.9 ScFv的初步鉴定 从上述第4 轮富集筛选的后涂布的平板上随机挑取20 个单菌落，制备噬菌体ScFv。以纯化的RdRp 原核表达产物为检测抗原，HRP 标记的抗M13 抗体(1∶2 000)为二抗，间接ELISA 法检测所制备的ScFv。同时设阴性对照(pET-32a 的原核表达产物)和空白对照(PBS)(n=3)，检测OD450nm值，将P/N>2.1 并且P>0.2(P=阳性值-阴性值，N=阴性值-空白值)的检测孔判为阳性scFv。

1.10 Sc Fv的可溶性表达及检测 按照上述方法制备阳性scFv 对应的噬菌体，按1∶100 比例接种至新鲜制备的HB2151 感受态，37 ℃缓慢震荡30 min 后高速振荡过夜；再按1∶100 比例加入2×YT-AG 培养基，37 ℃振荡培养1 h 后离心弃上清液；沉淀加入等量2×YT-AI 培养基，30 ℃振荡培养4 h 后离心弃上清液，沉淀加入500 μL PBS-EDTA(1 mmol/L EDTA)，冰浴30 min 后沸水浴5 min，高速离心收集上清液，即为可溶性表达的ScFv。

以抗E-tag 的MAb(1:4 000)为二抗，按照上述ELISA 方法检测可溶性表达的ScFv。

2 结果

2.1 DHV-1 RdRp基因扩增及克隆鉴定 以从DHV-1 感染的鸡胚中提取总RNA 为模板进行RTPCR 扩增，扩增产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增得到与预期大小相符的片段，约为1.4 kb(图1)。

将纯化回收的RdRp 基因克隆于pET-32a 构建pET-RdRp，pET-RdRp 经Kpn Ⅰ/Not Ⅰ双酶切鉴定(图略)后进行序列测定。结果表明，RdRp 基因序列与DHV-1 SH 株(HQ265433)的同源性为100 %。

图1 DHV-1 RdRp 基因的RT-PCR 扩增产物Fig.1 Amplification of DHV-1 RdRp gene by RT-PCR

2.2 免疫原鉴定、制备及免疫效价测定 含pETRdRp 的重组菌在不同培养温度、不同诱导剂浓度培养后，最终选取37 ℃、1 mmol/L IPTG、诱导4 h为最佳诱导条件。诱导产物经超声裂解进行SDSPAGE 分析，结果显示，与空载体相比，在68 ku 处出现了预期大小的重组蛋白，并以包涵体形式存在(图略)。分离免疫后的小鼠血清，间接ELISA 法测定的RdRp 抗体效价达1∶16 000。

2.3 VL、VH基因扩增及全长sc Fv基因的制备 以提取的免疫鼠脾脏总RNA 制备的cDNA 为模板，首先采用PCR 扩增获VL/VH编码序列，再通过SOE-PCR 经Linker 编码序列扩增全长scFv 基因，电泳检测结果显示：VL基因约为320 bp，VH基因约为340 bp，全长scFv 基因约为750 bp，均与预期大小相符(图2)。测序结果表明所得序列具有正确的表达阅读框，为VH-Linker-VL结构。

图2 VL、VH和scFv PCR 扩增产物Fig.2 Amplifications of the scFv gene by SOE-PCR

2.4 scFv文库的构建及鉴定 将纯化回收后的scFv 编码序列克隆于pCANTAB5E 载体中，随机挑取12 个单菌落，提取重组质粒，经Hin d Ⅲ/NotⅠ双酶切鉴定，均可获得约0.8 kb 和4.5 kb 的片段(图3)，表明scFv 片段正确插入pCANTAB5E 噬粒载体。根据转化平板上生长的菌落数，估算库容为2.9×106。

图3 富集前重组噬菌粒的双酶切鉴定Fig.3 Identification of recombinant phagemid before enrichment

2.5 scFv的富集淘选及初步鉴定 通过微孔板法对噬菌体scFv 库共进行了4 轮“亲和吸附-洗脱-扩增”的富集淘选，对每一轮的抗体库进行噬菌体滴度测定，结果显示，富集后的抗体库滴度比初级抗体库提高了约223 倍(表1)，表明特异性重组噬菌体得到了有效的富集。

随机挑取第4 轮富集筛选后的所涂平板上的20个单菌落，制备噬菌体scFv，以抗M13 抗体为二抗，ELISA 测定抗体与特异性抗原的结合情况。取3 组数据平均值，结果显示，参照P/N>2.1 并且P>0.2 的标准，可初步确定A1、A3、A5、A6、A7、A8、B2、B3、B4、B7 这10 株为重组ScFv(表2)。

表1 噬菌体抗体库的免疫亲和富集效果Table 1 Enrichment of phage display library

表2 ScFv 的ELISA 筛选结果Table 2 Screening the ScFv by ELISA

2.6 Sc Fv的可溶性表达及检测 将筛选到的10 株阳性scFv 在HB2151 中进行可溶性表达，以抗E-tag MAb 为二抗，ELISA 测定抗体与特异性抗原的结合情况。参照上述标准，取三组数据平均值，结果显示，A1、A3、A5、A7、A8、B4、B7 这7 株ScFv得到了可溶性表达，有较好的抗原结合活性(表3)。

表3 ScFv 的可溶性表达检测结果Table 3 Detection of the ScFv expressed in a soluble form

3 讨论

本研究在制备的具有免疫原性的RdRp 蛋白基础上，采用噬菌体展示技术，构建了DHV-1 RdRp的ScFv 文库；借助抗原抗体特异结合淘选、ELISA检测鉴定，获得了7 株具有良好抗原结合活性的scFv。这一DHV-1 RdRp 特异ScFv 的制备，在国内外属首次，为鸭病毒性肝炎防制新策略研究奠定了基础。

获得特异性好，亲和力高的抗体是建立免疫学检测方法和免疫治疗的前提。传统的MAb 虽然具有高特异性，但其筛选的技术条件较为严苛，工作量较大。ScFv 作为第3 代基因工程抗体，相对于MAb，具有结合位点特异、分子量小、免疫原性低以及易于筛选等优势，在医学诊断和治疗方面已得到广泛应用[6-9]。而在动物疫病防制方面，目前仅有新城疫scFv 的报道[13]。

连接肽Linker 的设计在scFv 的制备中至关重要，既不能对抗原结合部位造成阻碍，不能干扰VH和VL的空间构象，也不引起分子动力学改变并且尽可能减少蛋白酶降解及防止ScFv 聚集[14]，本研究选用了目前最广泛应用的(Gly4Ser)3序列。scFv 的取向方面，之前研究表明VH-linker-VL比VL-linker-VH的亲和力高10 倍以上，而VL-linker-VH比VH-linker-VL的表达量高20 倍[15]，我们选取了亲和力比较好的VH-linker-VL方式。对噬菌体ScFv 的淘筛方法，主要有微孔板法、免疫管富集筛选法及抗原生物素标记法，本实验采用了简单易行的微孔板法，经过4 轮富集筛选，得到了高滴度的特异性ScFv，这一结果进一步证明了我们所选择的链接肽、链接方式及淘选方法的确实有效性。

建立的噬菌体抗体库，将基因型和表现型统一于同一噬菌体颗粒中，既能够特异性识别抗原，又能感染宿主进行再扩增，实现了淘选与富集的同步，在不经杂交瘤途径的情况下实现对抗体的直接筛选[7]，是目前最广泛的ScFv 制备方法。ScFv 的编码基因可以借助于分子生物学方法得以串联表达，从而避开MAb 目标单一的缺点，可为建立特异、高效抗体为基础的疾病防制方法开辟新思路。

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