一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

付新亮，方 博，王丽芳，何淑仪，郑 运，纪方晓，曹振鹏，周 沛，陈济铛，粟 硕，张桂红

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

猪流感(Swine influenza，SI)是由A 型流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。1930 年Shope 首次分离鉴定了经典H1N1 亚型猪流感病毒(SIV)。其主要引起咳嗽、喷嚏、流鼻涕、体温升高、呼吸困难和食欲下降等症状，与其他病原混合感染，会使病情加重，死亡率增高，给养猪业造成严重经济损失。

SIV 属于正粘病毒科A 型流感病毒属，为单股负链分节段RNA 病毒，其基因组由8 个独立节段构成，编码至少10 种基因产物，其中节段1～3 分别编码PB2、PB1、PA 聚合酶，节段4 和节段6 分别编码血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，节段5 编码核蛋白(NP)，节段7 编码基质蛋白M1和离子通道蛋白M2，节段8 编码非结构蛋白NS1和NS2[1]。一般认为SIV 具有宿主限制性，很少跨越种间屏障在另外的宿主群内建立稳定的谱系。但由于猪体内呼吸道上皮细胞具有人流感病毒受体SA-α-2、6Gal 和禽流感病毒(AIV)受体SA-α-2、3Gal[2]，因此猪既可以感染人流感病毒又可以感染AIV，被认为是禽、猪、人等不同流感病毒基因重组或重配的“混合器”。目前在猪群中流行的SIV 主要有H1N1、H1N2和H3N2 3 种亚型。其中H1N1 亚型SIV 主要包括经典SIV、欧亚类禽H1N1 SIV 和甲型H1N1 SIV[3-6]。本研究从采集的样品中分离得到一株H1N1 亚型SIV，对其进行分子特征和遗传进化分析以及小鼠的致病性试验，为了解当前我国猪群中流行的SIV的来源与进化提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 样品采集、SPF鸡胚及实验动物 于2013 年11 月～12 月在广东省5 个猪场共采集疑似流感症状猪鼻拭子115 份，样品经双抗处理后用于病毒分离；10 日龄SPF 鸡胚购自华南农大生物药品有限公司；6 周龄雌性BALB/c 小鼠购自广东省医学实验动物中心。

1.2 主要试剂 TRIzol 总RNA 提取试剂购自天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV Reverase、Ex Taq DNA 聚合酶购自TaKaRa 公司；胶回收试剂盒购自MAGEN 公司。

1.3 引物设计 根据GenBank 中登录的A 型流感病毒的序列设计M 基因检测引物序列为：5'-CAAGACCAATCCTGTCACCTC-3'/5'-AAGACGAT CAAGAATCCACAA-3'；并设计扩增流感病毒8 个节段的8 对引物，其中HA 节段的引物序列为：5'-AGCAAAAGCAGGGG-3'/5'-AGTAGAAACAAGGG TGTTTT-3'；NA 节段的引物序列为：5'-AGCAAAAG CAGGAGT-3'/5'-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3'；其他节段的扩增引物参考文献[7]的序列；反转录引物为Unil-2：5'-AGCAAAAGCAGG-3'，引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.4 病毒分离与鉴定

1.4.1 鸡胚接种 将处理的拭子样品上清液经尿囊腔接种10 日龄SPF 鸡胚(0.1 mL)，于37 ℃孵化48 h，收集24 h 后死亡和存活的鸡胚尿囊液，测定其对鸡红细胞的凝集活性，有血凝性的阳性样品通过鸡胚接种有限稀释法纯化。对于血凝阴性尿囊液则在SPF 鸡胚中盲传3 代，如果仍然无血凝性则判为病毒分离阴性。

1.4.2 病毒核酸的提取和RT-PCR 鉴定 采用TRIzol 法提取病毒总RNA，以Unil-2 为引物，通过M-MLV 反转录制备cDNA，并以其为模板，采用A型流感病毒的M 基因检测引物进行PCR 扩增。反应条件为：95 ℃5 min；95 ℃1 min、54 ℃45 s、72 ℃1 min，30 个循环；72 ℃10 min，PCR 产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 全基因序列测定及分析 以制备的cDNA 为模板，采用A 型流感病毒各节段特异性PCR 引物扩增8 个基因片段。PCR 扩增产物分别经胶回收后克隆至pMD18-T 载体，提取重组质粒，由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序鉴定。

1.6 病毒遗传进化与分子特征分析 采用DNAStar软件对所测得的序列进行拼接，并与NCBI 数据库中的序列进行同源性比对，同时通过MEGA5.0 软件对HA 和NA 基因进行进化分析、绘制进化树，并对HA 和NA 推导氨基酸序列进行流感病毒分子特征分析。

1.7 小鼠致病性试验 将6 周龄雌雄BALB/c 小鼠分为实验组和空白对照组，每组10 只；实验组以106EID50/只的剂量经鼻腔接种病毒，接种后每天观察小鼠的临床症状、采食和饮水情况，定期称重并记录采食量，连续观察14 d，感染后第3 d 随机迫杀3 只小鼠，无菌采集肝脏、脾脏、肺脏和脑进行脏器中病毒滴度测定。

2 结果

2.1 病毒分离 将115 份鼻拭子接种SPF 鸡胚，盲传至第3 代，将通过血凝试验判为阳性的尿囊液，采用A 型流感的M 基因检测引物进行RT-PCR 检测，结果显示，扩增得到约750 bp 的目的片段(图1A)，分离得到一株流感病毒。

2.2 分离株各节段的RT-PCR扩增 以提取病毒总RNA 反转录制备的cDNA 为模板，采用A 型流感病毒各节段特异性PCR 引物分别进行各节段的RT-PCR 扩增，结果显示扩增的各片段大小均与预期相符(图1B)。对其全基因序列进行测定分析，结果表明该分离株为H1N1 亚型SIV，命名为A/Swine/Guangdong/L2/2013(H1N1)。

图1 SIV M 基因的RT-PCR 检测(A)及8 个节段扩增(B)结果Fig.1 Detection of the M gene(A)and eight segments(B)of SIV by RT-PCR

2.3 核苷酸同源性分析 通过NCBI 中的Blast 程序对该分离株的全基因序列进行比较，结果显示，PB2、PB1、HA、NA 和NS 5 个节段与A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1)同源性最高；而PA、NP 和M 基因片段与A/swine/Guangdong/33/2006(H1N1)同源性最高(表1)。

2.4 病毒分子特征分析 HA 基因序列测定结果显示，SIV A/Swine/Guangdong/L2/2013(H1N1)HA 基因编码区由1 698 个核苷酸组成，编码565 个氨基酸，裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GL，与高致病性AIV 含有多个碱性氨基酸裂解位点相比，具有典型的低致病性流感病毒特征。与参考株A/swine/Shanghai/2/2005 相比，该分离株HA 蛋白共有5 个氨基酸发生了突变，其中4 个位于HA1 蛋白中，分别为R62G、E144V、S278Y、S326N；1 个突变位点位于HA2 蛋白中，为S540P；另外该分离株在522 位发生了一个氨基酸的缺失(表2)。

NA 基因编码区由1 410 个氨基酸组成，编码470 个氨基酸。与参考株相比，有6 个氨基酸位点发生了突变，分别为L23M、I195L、R222K、D307N、K347N 和M415L，而糖基化位点未发生变化。

表2 A/Swine/Guangdong/L2/2013 与参考株HA 氨基酸比较Table 2 Amino acid of HA proteins of A/Swine/Guangdong/L2/2013 and the reference viruses

2.5 病毒遗传进化分析 对该分离株的HA 基因序列进行遗传进化分析，结果显示：A/Swine/Guangdong/L2/2013(H1N1)的8 个节段均位于经典SIV 亚群中，未同其他亚群进行重组，并与2005 年前后的经典SIV 株A/swine/Shanghai/2/2005 在同一分支，进化关系最近(图2)。同时对NA 的基因序列进行遗传进化分析，其结果与HA 的进化分析结果相符(图3)。

2.6 小鼠的致病性试验 小鼠接种病毒后出现的临床症状主要表现为食欲下降，行动迟缓。实验组小鼠的体质量在1 d～5 d 缓慢下降，并在6 d 以后体质量开始逐渐恢复，表明A/Swine/Guangdong/L2/2013(H1N1)分离株不需要经过适应，可以直接感染小鼠并具有一定的致病性，导致小鼠体质量降低(图4A)，但所有感染小鼠并未发生死亡。组织病理学观察表明，感染小鼠第3 d 表现为以肺脏充血和渗出性炎症为特征的肺炎症状(图4B)。小鼠脑、肝、肾和脾中均未分离到病毒。迫杀的3 只小鼠肺脏的病毒滴度分别为104.25EID50、104.5EID50和103.75EID50，表明病毒仅能够在呼吸道复制。

图2 分离株HA 基因进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on HA gene of the isolate strains

图3 分离株NA 基因进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on NA gene of the isolate strains

图4 病毒接种后小鼠体质量变化(A)和组织病理学变化HE(400×)(B)Fig.4 Weight changes of mice after inoculate with A/Swine/Guangdong/L2/2013(A)and the pathological(HE)in tissues of lungs at days 3 after inoculate(B)

3 讨论

我国于1991 年首次分离到SIV，自1998 年～2005 年，美洲来源的经典H1N1、欧洲来源的类禽H1N1 和三源重配H1N1 流感病毒在我国南部地区的猪群中共同流行，同时还有人的季节性流感病毒。但从2005 年之后，欧亚类禽SIV 的流行在猪群中逐渐占主导地位，并且于2009 年从猪群中分离到甲型pdm09 病毒株[8-10]。

本研究从猪场采集的鼻拭子样品中分离到一株流感病毒，进行全基因序列分析，鉴定为H1N1 亚型SIV；同源性分析结果显示：该分离株的PB2、PB1、HA、NA 和NS 5 个节段与A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1)具有较高的同源性，而PA、NP 和M 3 个基因片段与A/swine/Guangdong/33/2006(H1N1)具有较高的同源性，后两者属于经典SIV；对该分离株的氨基酸序列分析显示，与参考株A/swine/Shanghai/2/2005 相比，该分离株HA 蛋白共有5 个氨基酸发生了突变，另外该分离株还在522 位发生了一个氨基酸的缺失，缺失位点位于跨膜区附近，对病毒HA 蛋白的功能影响不大，并且该分离株潜在的糖基化位点与参考株一致。遗传进化分析表明，该分离株与A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1)的进化关系最近，均位于经典SIV 亚群，未发生重组，表明经典SIV 仍然在我国猪群中流行；小鼠致病性试验表明，该分离株可以直接感染小鼠，引起小鼠体质量降低，虽然未引起明显的临床症状，但可以在小鼠肺脏内增殖，导致肺脏出现病理变化。表明该分离株对小鼠呈低致病性，尚未获得感染其他组织器官的能力。

猪被认为是AIV 对人的适应过程的中间宿主或是作为遗传学上重配病毒的混合器[11]。因此及时掌握我国猪群中SIV 流行株的变异情况，为猪群中流感病毒的检测及其科学防制提供依据，具有重要的公共卫生学意义。本研究从猪群中分离到的H1N1亚型SIV 是否会在猪群中持续进化，然后发生重组，并由猪传染给人，以及其是否会对猪造成更严重的致病性有待于进一步监测和研究。

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