动物源肠外致病性大肠杆菌毒力因子研究进展

郭 霞，孔令聪，刘树明，马红霞,2*

(1.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学 动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林 长春 130118)

动物源肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC)是一种能够引起动物肠道外严重感染的病原体，包括新生儿脑膜炎致病性E.coli(Neonatal meningitis E.coli，NMEC)，尿道致病性E.coli(Uropathogenic E.coli，UPEC)，败血症E.coli(如禽致病性E.coli，Avian pathogenic E.coli，APEC)，乳腺炎致病性E.coli(Mammary pathogenic E.coli，MPEC)，子宫内膜致病性E.coli(Endometrial pathogenic E.coli，EnPEC)，肺炎致病性E.coli(Pneumonia pathogenic E.coli，PPEC)等肠外致病性E.coli，其引发的疾病已给畜牧业造成严重的经济损失。动物源ExPEC 具有人畜共患的特性，也给人类的健康造成了潜在的威胁[1]。

动物源ExPEC 通过相关毒力因子定植于宿主粘膜表面，逃避或破坏宿主局部和全身的免疫系统，从而导致宿主发病。研究认为动物源ExPEC 的毒力因子主要包括粘附因子、免疫逃避相关毒力因子和代谢相关毒力因子。本文就其主要毒力因子及其调控子的研究进展做以综述。

1 粘附因子

粘附是微生物在宿主表面成功定植的第一步，ExPEC在宿主定植过程中产生多种粘附素，包括菌毛粘附素和非菌毛粘附素。菌毛粘附素包括Ⅰ型菌毛粘附素、P 菌毛粘附素和卷曲菌毛粘附素；非菌毛粘附素包括非菌毛粘附物质、温度敏感凝集素、自转运蛋白粘附素和其他粘附素。目前，已知动物源ExPEC 的粘附素有7 种，其编码基因、特异性粘附受体和体内外感染模型如表1 所示：

1.1 Ⅰ型菌毛粘附素 1984 年Naveh 等首次报道了Ⅰ型菌毛在APEC 感染中的致病作用，并通过体内和体外粘附实验证明其能够粘附于鸡气管上皮细胞[2]。之后，Krogfelt等研究证明了Ⅰ型菌毛的粘附作用均由亚基fim H 介导，并且证明Ⅰ型菌毛粘附素为甘露糖受体特异性粘附素[3]。Krekeler 等进一步构建犬子宫内膜致病E.coliⅠ型菌毛粘附素fim H 亚基突变株，并通过子宫活检对比判定突变株与野生株结合犬子宫内膜上皮细胞的能力，定量与定性地表明了犬子宫内膜E.coliⅠ型菌毛fim H 亚基在粘附犬子宫内膜过程中起重要作用[4]。随后他们还构建了引起犬子宫蓄脓E.coli 的fim H、papG III 和sfa 单个、两个和3 个粘附素基因缺失株，结果显示，单个或者两个粘附素缺失株与野生株粘附子宫内膜的能力无显著差异，而3 个粘附素缺失株的粘附能力却显著下降，表明Ⅰ型菌毛粘附素与其他菌毛粘附素之间具有相互补偿的能力[5]。

表1 动物源ExPEC 粘附素编码基因、特异性受体及相关感染模型

1.2 P菌毛粘附素 P 菌毛最初发现于人UPEC 中，其尖端的粘附分子papG 可介导其对尿道上皮细胞的粘附。根据受体差异可将papG 分为papGⅠ、pap GⅡ和pap GⅢ。pap GⅡ在所有的等位基因中分布广泛，并且papGⅡ和papGⅢ也与哺乳动物源(包括人)的papGⅡ和papGⅢ(相应的)papG 序列具有高度同源性[6]。Lillington 等发现在菌毛装配过程中，p 菌毛大亚基pap A 亚基较Ⅰ型菌毛大亚基fim A 亚基与引座子的亲和性较小，而且papG 粘附素和fim H 粘附素相比虽然与宿主是较弱的滑动结合方式，却更适合于在更多日常冲刷下的肾脏组织生存，从而加强了细菌在体内的生存能力[7]。笔者所在实验室对从猪肺炎E.coli 进行基因组测序结果表明其携带有pap GⅡ，并且与人脑炎E.coli 该基因的同源性高达99 %，但其在粘附过程中是否发挥作用还有待于进一步研究。

1.3 卷曲菌毛粘附素 卷曲菌毛是E.coli 在体外处于特定条件下表达的淀粉样纤维，最早发现于牛MPEC[8]。其可以结合纤连蛋白，引发细菌自动聚集和生物膜形成，还可增强细菌粘附、侵袭和定植，并可能与细菌引发的败血症相关[9]。Ragione 等发现卷曲菌毛能增强APEC 的粘附和定植能力，如果卷曲菌毛的表达受到抑制则APEC 存活能力也随之下降[10]。其还可以与纤连蛋白结合并粘附到宿主细胞表面，介导APEC 对真核细胞侵入以及其被真核细胞内化[11]。同时，采用X 射线对促进E.coli 卷曲菌毛分泌的关键亚基csgG 蛋白进行结构分析，结果显示，该蛋白是闭塞的、无选择性的蛋白分泌通道[12]。此外，本实验室对一株猪源ExPEC 全基因组进行高通量测序，结果显示，其携带有编码卷曲菌毛粘附素的基因，但其是否与猪源ExPEC 在肺部定植感染相关有待证实。

2 免疫逃避相关毒力因子

2.1 荚 膜 荚膜是E.coli 引起肠道外感染的重要因素。当敲除了与荚膜多糖输出相关的kpsM 基因后，猪脑炎PCN033 突变株的粘附、抗吞噬作用和抗补体介导的血清杀菌能力均显著下降[13]。现已证实，新生儿脑膜炎E.coli的K1 荚膜在免疫逃避中起着至关重要的作用，K1 荚膜能够增强新生儿脑膜炎E.coli 在人微血管内皮的细胞内存活能力，并能调节含液泡的新生儿脑膜炎E.coli 的成熟并且能阻止溶酶体的融合，因而可穿过血脑屏障而使宿主致病[14]。

2.2 血清抗性蛋白 APEC 的血清抗性蛋白能够帮助该菌避免与血清中的补体结合，可介导APEC 的免疫逃避。APEC 的血清抗性主要依靠来自质粒的traT(表面排斥分子)和iss(增加血清生存基因簇)，前者能够在细胞表面暴露的情况下防止细胞裂解，增加APEC 的血清抗性，但其功能特异性位点未知[15]；而后者最初发现于人败血症E.coli 分离株中，能够显著增强人败血症E.coli 的补体结合抗性。APEC 的iss 和traT 缺失株均能导致其在血清的存活能力下降，但其在E.coli χ7122 却不具有抗血清作用[16]。Johnson 等鉴定iss 基因有3 种亚型，其中1 型iss 在APEC 和NMEC 中流行广泛，但在UPEC 中却少见[17]。

2.3 外膜蛋白 外膜蛋白(Outermembraneprotein，OMPs)是外膜的主要组成成份，包括锚定脂蛋白和跨膜贝塔折叠蛋白，可以介导细菌定植、侵袭和免疫逃避。如脑膜炎E.coli OmpA 通过结合补体C4b，介导其血清抗性，并且其对数期菌体通过促进补体C4b 介导的补体C3b 和C4b的降解避免血清杀伤作用[18]。Liu 等发现猪源ExPEC 脑炎株PCN033 OmpC 和OmpF 蛋白抗血清能介导补体依赖的调理吞噬作用[19]。此外，通过构建ExPEC O42 株外膜蛋白TolC 基因缺失株，结果发现，与亲本株相比其被膜形成能力显著下降，而且丧失了产生卷曲菌毛的能力[20]。

3 代谢相关毒力因子

动物宿主组织中可用的可溶性铁离子很有限。ExPEC能够在低铁压力下使宿主致病，主要是通过以下3 种策略：(1)位于内膜的转运系统SitABCD 作为ATP 离子泵将宿主周质中的二价铁离子运输至细胞内。(2)通过转运系统-ChuA 和Hma 从宿主和细胞外的血红素摄取铁。(3)通过铁载体外膜受体蛋白-IroN、IreA、IutA 等从宿主的乳铁蛋白和转铁蛋白中得到铁。已知ExPEC 可以合成4 种不同的铁载体：即气杆菌素、沙门菌素、叶尔森杆菌素和肠杆菌素，铁载体与ExPEC 的侵袭、内化和系统感染如败血症有关。潘海珠通过分别构建气杆菌素合成基因iucC 和其外膜蛋白受体iutA 的基因缺失株，证实iucC 基因在APEC E058 株气杆菌素合成中发挥重要作用，而iutA 的缺失不影响气杆菌素的合成，但缺失株的鸡胚死亡率低于野生株[21]。沙门菌素受体IroN 在UTI CP9 与侵袭尿路上皮细胞有关[22]。叶尔森杆菌素能够在宿主体内摄取铁，并能够在人尿道促进生物膜的形成[23]。由于铁载体外膜蛋白是ExPEC 保持完整毒力必须的铁载体的外膜蛋白，因此ExPEC 外膜蛋白受体有望成为治疗ExPEC 感染的新靶点。

4 毒力因子调控系统

ExPEC 与肠内E.coli 侵染部位和生存环境有所不同，其如何根据不同的外界信号刺激表达不同的毒力因子，促进其在不同的组织内生存已成为目前研究热点之一。毒力因子调控系统包括二元信号传导系统(TCSTS)、群体感应系统(Quorum sensing，QS)和毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin，TA)等。

4.1 TCSTS 该系统是细菌内的主要信号传导系统，能够使病原体对环境诱因进行感知并调节病原菌的代谢，使其适应环境的改变，从而侵袭宿主。经典的TCSTS 由两个相互作用的蛋白组成(例如BarA/UvrY 和EnvZ/OmpR等)，可以通过磷酸化过程调控靶基因的表达。Herren 等通过体内和体外试验证明，BarA/UvrY 可能是APEC 的全局调控子，影响了多种毒力因子的表达，BarA/UvrY 的缺失导致APEC 的Ⅰ型菌毛和P 菌毛的表达量下调，减弱胞外多糖的产生，增加对氧化应激的敏感性[24]。但Palaniyandi 等发现BarA-UvrY 缺失的UPEC 突变株的溶血素、脂多糖、炎性细胞因子(TNF-α 和IL-6)和趋化因子(IL-8)的表达量显著下降[25]。BarA/UvrY 在不同源的ExPEC 中调控的靶基因有所不同，笔者认为这可能与感染部位的环境差异有关。此外，Rentschler 等发现UPEC 的EnvZ/OmpR 中ompR 调控子能感受低pH/高渗透压，特别是在高渗透压下能降低fimB 的转录水平，导致Ⅰ型菌毛的表达减少，降低了以Ⅰ型菌毛为靶位的吞噬细胞吞噬的可能性，从而更适应宿主环境[26]。但动物源ExPEC 的二元调控子的靶基因及调控机制还有待进一步研究。

4.2 QS系统 该系统是细菌间细胞-细胞交流的通讯系统，能够合成、释放和探测细胞外信号分子-自体诱导物，使细菌在密度依赖的模式中调控基因的表达。QS 在一些物理状态下，与生物体发光、被膜形成、毒力、抗生素生成以及与其他细菌的竞争生存等相关。Han 等研究发现，QS 的调控子LuxS 缺失的APEC 的粘附、侵袭和致病性明显降低，其IucD、FyuA、Vat、OmpA、Iss、FimC 和Tsh 的表达水平也降低[27]。随后，Palaniyandi 等通过同样的方法构建了APEC LuxS 缺失株，也发现其致病性显著降低，大多数缺失株O-抗原消失并且脂多糖含量下降了至少2 倍，其逃避鸡巨噬细胞的吞噬能力和侵袭鸡成纤维细胞的能力也显著下降[28]。Chaudhari 等利用不同浓度的群体感应QseC 重组蛋白刺激禽巨噬细胞样细胞，并将其与APEC O78 共同培养，发现刺激后生长速度变慢，生长至对数期时间延长，AufA、FliC、FimH、FyuA、IucC、IutA、MsbB 和Vat 的表达水平显著下调；同时QseC 刺激禽巨噬细胞能够有效诱导IFN-γ、TLR-4 和TLR-15 的表达，这些蛋白具有免疫原性，并诱导宿主产生免疫反应，这提示QseC 有望成为抗APEC 感染的潜在疫苗靶位[29]。

4.3 AT系统 该系统是由一个稳定的毒素蛋白和与其共表达并且受其抑制的不稳定抗毒素蛋白组成，如YefMYoeB、YbaJ-Hha、PasT-PasI 等，其中抗毒素蛋白是小的反义RNAs，能够抑制毒素基因的翻译，TA 系统能够帮助细菌更好的应对应激环境和生存压力。Norton 等在已经测序的UPEC 中发现了3 对TA 调控子：YefM-YoeB、YbaJ-Hha、PasT-PasI，其中前两对调控子可以促进UPEC在膀胱中定植，第3 对能够增强ExPEC 在抗生素压力的情况下其被膜的形成，在营养限制、氧压力和硝酸化压力的状况下显著增强病原体的耐受能力，并且证明了与pstT毒性相关的N 端区域能够促进细菌的持留[30]。但动物源ExPEC TA 系统的其他调控子还未见报道。

此外，随着对ExPEC 毒力调控系统研究的不断深入，发现细菌转化控制系统和新型分泌系统-VI 型分泌系统(Type VI secretion system，T6SS)在对其毒力因子调控中发挥一定作用。Mu 等发现干扰APEC 转运RNA-小蛋白B或转运RNA-小RNA 能够显著降低其毒力，并且转录调控基因rfaH 和荚膜输出蛋白kpsM、铁载体受体chuA 和血清抗性蛋白iss 的基因表达水平均显著降低[31]。此外，T6SS 核心基因(clpV 和hcp)的缺失能够导致APEC SEPT362 的Ⅰ型菌毛表达量下降，粘附上皮细胞能力下降，并促进肌动蛋白重排[32]。赵丽丽等发现猪脑炎株PCN033 的T6SS 系统中vca-0107 的缺失可引起粘附能力的显著下降，而毒力却无明显变化[33]。但T6SS 基因簇编码的其他蛋白质的功能研究还未见报道。

5 小结与展望

综上所述，有关动物源ExPEC 的毒力因子及调控系统的研究已经较为深入，其毒力因子调控系统中相关毒力因子的分泌、表达机制还有待进一步阐明。近年来已发现TCSTS、QS、TA 和T6SS 毒力因子调控系统与ExPEC 关键致病过程密切相关，为此进一步阐明其与ExPEC 致病相关的调控机制，不但能够为该病的防治提供依据，而且能够为新型抗生素靶位的筛选提供新的视角。

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