高效液相色谱法测定橙皮苷磷脂复合物中橙皮苷含量

张 卿，管海燕，金 竹，卢来春

（中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科，重庆 400042）

高效液相色谱法测定橙皮苷磷脂复合物中橙皮苷含量

张 卿，管海燕，金 竹，卢来春

（中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科，重庆 400042）

目的 建立测定橙皮苷磷脂复合物中橙皮苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法 色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为乙腈-0.5%醋酸水溶液(25∶75)，流速为1.0 mL/min，检测波长283 nm，柱温30℃，进样量20 L。结果 橙皮苷进样质量浓度在5.19～103.73 g/mL(r=0.999 5)范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率为101.02%(RSD=1.30%)，橙皮苷磷脂复合物中橙皮苷的平均含量为282.5 g/mg。结论 该法准确可靠、重复性好，可用于橙皮苷磷脂复合物的含量测定。

橙皮苷；磷脂复合物；高效液相色谱法；含量测定

橙皮苷是橙皮素与芸香糖形成的糖苷，为二氢黄酮衍生物，呈头发样针状晶体，白色或苍白色，熔点258～262℃，广泛存在于豆科、唇形花科、蝶形花科、芸香科、柑橘属植物中，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫力、防辐射、保护心血管系统等药理活性[1]。但其水溶性和脂溶性差，口服绝对生物利用度低[2]。口服给药是大多数药物最好的给药途径，可以提高患者的顺应性，且经济、安全，但许多有前景的脂溶性或水难溶性药物生物利用度低[3]。因此，选用合适的载体和制剂技术改善其理化性质，提高与胃肠道黏膜的亲和性和透过性等，是促进其口服吸收的有效途径[4]。将中药活性成分与磷脂制成磷脂复合物后，可明显增加中药活性成分的吸收，提高其生物利用度，增强其药理效应[5]。为此，本研究中制备了橙皮苷磷脂复合物，并建立了测定其含量的高效液相色谱(HPLC)法。

1 仪器与试药

1200型高效液相色谱仪(安捷伦公司)；sartorius BT 25S型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；磁力搅拌器（上海江星仪器有限公司）；FD-1C型冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司)。橙皮苷原料药（含量为95.5%，批号为20131214），橙皮苷标准品（含量为98.79%，批号为20130413），均购自大连美仑生物技术有限公司；大豆卵磷脂（上海太伟药业有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯；水为双蒸水；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.5%醋酸水溶液(25∶75)；检测波长：283 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

2.2 样品制备[6]

取处方量的橙皮苷和大豆卵磷脂，加入二甲亚砜(DMSO)-甲醇混合溶液作为反应溶剂，50℃下搅拌1 h，-80℃预冻，然后冷冻干燥除去反应溶剂，即得到橙皮苷磷脂复合物。经红外光谱(IR)、差示扫描量热(DSC)分析，证明该复合物是橙皮苷和磷脂通过物理作用结合在一起的。

2.3 方法学考察

专属性考察：称取橙皮苷对照品，精密称定，溶于DMSO-甲醇混合溶液10 mL，再取上述溶液0.5 mL，溶于甲醇10 mL制成质量浓度为97.9 mg/L的对照品溶液。同样方法制备处方量的大豆卵磷脂溶液和橙皮苷磷脂复合物溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果显示，大豆卵磷脂不干扰橙皮苷的测定，符合系统适用性要求，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：称取 10.5 mg橙皮苷标准品，精密称定，置100 mL容量瓶内，加甲醇溶解并定容，得橙皮苷贮备液。精密吸取橙皮苷贮备液，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，分别制得质量浓度为5.2，10.4，20.8，41.5，51.9，83.0，103.7 μg/mL的系列溶液。取上述系列溶液，分别按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。以进样质量浓度为横坐标、橙皮苷峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y=23.12 X-1.89(r=0.999 5)。结果表明，橙皮苷进样质量浓度在5.19～103.73 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取质量浓度为51.9 μg/mL的橙皮苷贮备液，按拟订色谱条件连续进样 5次，测定峰面积。结果的 RSD= 0.23%（n=5），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批号样品，平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的 RSD为1.59%（n=6），表明方法重复性良好。

回收试验：取约12，15，18 mg的橙皮苷标准品，精密称定，置100 mL容量瓶中，加入处方量的大豆卵磷脂，用DMSO-甲醇混合溶液溶解并定容。分别按拟订色谱条件进样测定，以外标法计算。结果见表1。

表1 橙皮苷回收试验结果（n=9）

2.4 样品含量测定

精密称取橙皮苷磷脂复合物(相当于橙皮苷30 mg)，置10 mL容量瓶中，加DMSO-甲醇混合溶液溶解并定容，12 000 r/min离心10 min，精密量取0.5 mL续滤液置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，作为供试品溶液。按拟订色谱条件进样测定，以外标法计算含量。取样品3批，制备成供试品溶液，进样分析，记录峰面积，计算橙皮苷的含量。结果3批样品中橙皮苷的平均含量为282.5 μg/mg。

3 讨论

参照2010年版《中国药典(一部)》橙皮苷的含量测定方法，其流动相为甲醇-醋酸-水（35∶4∶61），结果分离度不好。分别比较了甲醇-0.5%醋酸水溶液、乙腈-0.5%醋酸水溶液、乙腈-5 mmol/L醋酸铵溶液的分离效果，结果表明，以乙腈-0.5%醋酸水溶液为流动相时分离度、峰形、理论板数较好。根据出峰时间调整流动相比例，最终选择乙腈-0.5%醋酸水溶液（25∶75）作为流动相。

本试验中建立了测定橙皮苷磷脂复合物中橙皮苷含量的HPLC法，在拟订色谱条件下，辅料、溶剂对测定无干扰，结果准确，方法重复性好，可有效控制该制剂的质量，为进一步研制橙皮苷口服制剂奠定了基础。

[1]钱俊臻，王伯初.橙皮苷的药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2010，22(1):176-180.

[2]凡小燕，李 俊，王 雯，等.橙皮苷自微乳在大鼠小肠的吸收动力学[J].安徽医科大学学报，2011，46（8）:754-758.

[3]Pinnamaneni S，Das NG，Das SK.Formulation approaches for orally administered poorly soluble drugs[J].Pharmazie，2002，57（5）:291-300.

[4]江 波，印春华.提高难溶性药物口服生物利用度的方法[J].中国医药工业杂志，2002，33（7）:358-362.

[5]孙 燕，高 尔，王汝琴.中药活性成分磷脂复合物研究进展[J].医学综述，2007，13（11）:875-877.

[6]张 颖，李 楠，王彩云，等.HPLC测定鲑鱼降钙素磷脂复合物的含量[J].华西药学杂志，2013，28（6）:623-625.

Determination of Hesperidin Content in Hesperidin-Phospholipid Complex by HPLC

Zhang Qing,Guan Haiyan,Jin Zhu,Lu Laichun (Department of Pharmacy,Research Institute of Field Surgery,Daping Hospital of Third Military University,Chongqing,China 400042)

Objective To establish a HPLC method for the content determination of hesperidin-phospholipid complex.M ethods The chromatographic separation was performed on a Diamonsil C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with a mobile phase of acetonitrile-0.5% acetic acid aqueous solution(25∶75).The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 283 nm.The column temperature was maintained at 30℃ and the inject volume was 20 μL.Results Hesperidin in the range of 5.19-103.73 μg/mLshowed the good linear relation(r=0.999 5).The average recovery rate was 101.02%(RSD=1.30%).The average content of hesperidin contained in hesperidin-phospholipid complex was 282.5 μg/mg.Conclusion The established method in this study is accurate,reliable and reproducible,and can be used for the content determination of hesperidin-phospholipid complex.

hesperidin;phospholipid complex;HPLC;content determination

张卿，硕士研究生，药师，主要从事中西药物新型给药系统研究，（电话）023-68757098（电子信箱）zhangqingzq023＠163.com；卢来春，博士研究生，副主任药师，主要从事创新药物及制剂的研究，本文通讯作者，（电话）023-68757091（电子信箱）lulaicq＠163.com。

2014-11-13)

重庆市卫生局中医药科技项目，项目编号:ZY20132058。

R284.1；R282.71

A

1006-4931(2015)13-0030-02