盐酸克伦特罗对人类诱导多能干细胞来源心肌细胞的毒性作用

杨　慧　吴劭一　毛益申　王青洁　刘　琛　周　奕　孙　宁,*

sunning@fudan.edu.cn

盐酸克伦特罗对人类诱导多能干细胞来源心肌细胞的毒性作用

杨慧1吴劭一2毛益申1王青洁1刘琛3周奕2孙宁1,*

sunning@fudan.edu.cn

【摘要】目的：探讨盐酸克伦特罗对人类诱导多能干细胞(iPSC)来源心肌细胞的毒性作用。方法：将人皮肤来源的iPSC成功定向分化为心肌细胞，加入不同浓度盐酸克伦特罗，使之分为对照组(0μg/ml)、1μg/ml组、 10μg/ml组、20μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组等6组(n均=3)，相同条件共培养7天后，观察盐酸克伦特罗对心肌细胞形态大小、搏动频率及凋亡率的影响 。结果：不同浓度盐酸克伦特罗均可使心肌细胞缩小(P<0.05)，50-100μg/ml盐酸克伦特罗可致心肌细胞骨架断裂，甚至呈颗粒状。各种浓度盐酸克伦特罗均致心肌细胞搏动频率加快(P<0.05)，且有浓度越高搏动越快的趋势。10μg/ml组和50μg/ml组所致心肌细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。 结论：盐酸克伦特罗对人类皮肤来源iPSC分化的心肌细胞有毒性作用。

【关键词】盐酸克伦特罗；诱导多能干细胞；心肌细胞；凋亡

Myotoxic Effects of Clenbuterol on Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

YANG Hui1，WU Shao-yi2，MAO Yi-shen1，Wang Qing-jie1，LIU Chen3，ZHOU Yi2，SUN Ning1,*

1Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Research Center on Aging and Medicine, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China；2Shanghai Middle School, Shanghai,200231；3Department of Cardiac Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China;*Corresponding author

【Abstract】Objective: To investigate the toxic effects of clenbuterol hydrochloride (CL) on cardiomyocytes (CMs) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Method: Pluripotent stem cells derived from human skin fibroblasts were directly differentiated into CMs. The iPSC-derived CMs (iPSC-CMs) were then randomly divided into 6 groups and treated with different concentrations of CL. The cellular structure, beating frequency and apoptosis rates of these iPSC-CMs were evaluated in groups.Results: After CL treatment, iPSC-CMs morphologically exhibited a smaller size. Under 50-100μg/ml of CL, myofibers of the iPSC-CMs seemed irregular and exhibited a granular morphology. The beating frequency of iPSC-CMs and CL concentration were positively correlated. Compared with the control, the apoptosis rates in iPSC-CMs treated with 10μg/ml and group 50μg/ml were significantly increased.Conclusion: CL has toxic effects on human cardiomyocytes derived from hiPSCs.

【Key words】Clenbuterol; iPSCs; Cardiomyocytes; Apoptosis

盐酸克伦特罗，一种人工合成的β2肾上腺素受体激动剂，为白色或类白色结晶粉末，化学性质较稳定，易溶于水、乙醇，微溶于丙酮，难溶于乙醚[1]，是“瘦肉精”的主要代表药物，既能加速脂肪的分解，又能减少脂肪的合成，实现动物营养再分配，从而提高胴体瘦肉率和加快动物生长[2]。但若过量摄食，可引起中毒症状，如血压升高、血管扩张、心率加快、呼吸加快、体温上升、心脏和肾脏负担加重等，并出现

行为动作失调、神经紧张甚至全身震颤[3]。已有动物实验表明盐酸克伦特罗可导致大鼠肝实质细胞自噬[4]、家兔心肌细胞肥大、坏死和凋亡[5]。但对人类组织细胞，包括心肌细胞的毒性研究尚未见报道，原因与人类组织细胞难以获取有关。随着人类诱导多能干细胞(iPSC)及定向分化技术的发展，人类组织细胞来源及其相关研究成为可能。本文用人类皮肤细胞来源iPSC定向分化为心肌细胞，并观察不同浓度盐酸克伦特罗对人类iPSC-心肌细胞形态、结构和功能的影响，为"瘦肉精"对人类心肌细胞的毒性作用提供理论依据。

1材料与方法

1.1　试剂和仪器

1.1.1实验试剂：盐酸克伦特罗(Sigma,C5423,德国)白色粉末，实验时用去离子水溶解，配制成10μg/ml后，200μm的过滤网过滤除菌。Annexin Ⅴ 凋亡试剂盒(东仁化学有限公司，AD10，中国)；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(Milipore，ca92590，美国)；肌钙蛋白(Abcam，ab45932，美国)；肌小节蛋白(Abcam, ab18061，美国)；阶段特异性胚胎表面抗原4 (SSEA4，Abcam,ab16287,美国)；八聚体结合转录因子4 (Oct4，Abcam，ab18976，美国)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Abcam，ab104140，美国)；山羊抗小鼠IgG二抗，iFluor 488荧光标记(AAT Bioquest，AAT-16448，美国)；山羊抗兔IgG二抗，iFluor 594荧光标记(AAT Bioquest，AAT-16628，美国)；DMEM培养液(Corning，美国)；RPMI 1640培养液(Corning，美国)；mTesR1(Stemcell Technology Inc，加拿大)；CHIR99021 (无锡金谱，IWN1011，中国)；IWR-1(无锡金谱，IWN1007，中国)；B27(Life technologies，A1895601，美国)。

1.1.2 实验仪器：多电极微阵列(Multichannel Systems, m200，德国)；荧光显微镜(Leica，DMI3000B，德国)；流式细胞仪(BD FACS Calibur, EPICS®ALTRATM，美国)

1.2　实验方法

1.2.1人类iPSC制备：(1)供体为中国男性(24岁)，取其皮肤，参照文献方法，采用CytoTune®-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit(Life technology，美国)对成纤维细胞进行重编程为iPSC细胞系(iPSC-SF1)。(2)iPSC ALP检测：将iPSC-SF1接种于铺有matrigel的6孔板中，加2ml mTesR1培养液于37℃培养箱(含21% CO2和5% O2)中培养，待密度达50%左右时，用4%多聚甲醛固定1min，按ALP检测试剂盒提供的方法进行染色和结果判断。(3)iPSC干性标志蛋白检测：将iPSC-SF1接种于铺有matrigel及盖玻片的12孔板中，用mTesR1培养液培养，待密度达50%左右时，用4%多聚甲醛固定，分别加入一抗(1∶150)和SSEA4(1∶200)，山羊抗小鼠IgG二抗(iFluor 488荧光标记,1∶200)和山羊抗兔IgG二抗(iFluor 594荧光标记,1∶200)。用含DAPI的封片剂封片，并于荧光显微镜下观察。

1.2.2iPSC向心肌细胞定向分化：将人iPSC接种于铺有matrigel的6孔板中，用mTesR1培养液培养，至密度达80%-90%时，将培养液换成含2% B27的RPMI 1640，并加12μm CHIR 99021作用48h后，再换成5μm IWR-1 作用48h，之后一直使用含2% B27的RPMI 1640培养，直到显微镜下观察到细胞跳动为止。

1.2.3心肌细胞分组培养和处理：取上述心肌细胞，用胶原酶Ⅰ及0.05%胰酶消化成单细胞，接种在铺有盖玻片的12孔板中，每孔约1×105个细胞，每孔加入1ml含10%FBS DMEM培养液，共18孔，随机分为6组，每组3个复孔，并分别加10μg/ml盐酸克伦特罗应用液0μl(对照组)、0.1μl(1μg/ml组)、1μl(10μg/ml组)、2μl(20μg/ml组)、5μl(50μg/ml组)、10μl(100μg/ml组)，隔天换液,于37℃培养箱中共培养7天，进行以下实验。

1.2.4肌钙蛋白和肌小节蛋白检测：取上述培养7天的心肌细胞，用4%多聚甲醛固定，分别以1∶150、1∶200的浓度染一抗(肌钙蛋白cTnT，肌小节蛋白α-Actinin)和二抗，用含DAPI的封片剂封片，荧光显微镜观察,并通过肌小节蛋白染色，应用ImageJ软件分析统计心肌细胞形态和大小变化。

1.2.5心肌细胞搏动频率检测：取上述各组心肌细胞接种于多电极微阵列芯片中，每孔约1×104个细胞，加10%FBS 的DMEM培养液于37℃培养箱中培养48h后，按多电极微阵列检测仪提供的方法分别检测各组心肌细胞搏动频率。

1.2.6心肌细胞凋亡率检测：选取上述对照组、10μg/ml组(低浓度组)、50μg/ml组(高浓度组)iPSC-心肌细胞接种于6孔板中，每孔约5×105个细胞，培养12h后，按Annexin Ⅴ 凋亡试剂盒提供的方法处理细胞，并于1h内上流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。

1.3　统计学处理

2结果

2.1　人类iPSC鉴定

人皮肤成纤维细胞来源的iPSC-SF1细胞系克隆在mTesR1培养液中呈圆形或多边形，细胞连接紧密，单层生长，核质比高(图1A)，ALP染色阳性(图1B)，Oct4与SSEA4染色呈阳性(图1C-F)，说明该iPSC细胞系干性保持完好，具有向下游分化的潜能[6, 7]。

2.2　人类iPSC定向分化的心肌细胞鉴定

采用单层2D分化方法定向分化的心肌细胞呈堆积生长趋势(图1G)，显微镜下观察到自主收缩活动, iPSC-心肌细胞的标志蛋白肌小节蛋白a-Actinin与肌钙蛋白cTnT染色均为阳性(图2对照组)，符合心肌细胞特征[8, 9]。

2.3　不同浓度盐酸克伦特罗对心肌细胞大小和形态的影响

对照组iPSC-心肌细胞呈圆形、椭圆形或多边形，细胞贴壁良好，生长正常。在不同浓度盐酸克伦特罗作用下培养7天，10μg/ml组-100μg/ml组细胞较对照组缩小，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。50μg/ml组和100μg/ml组心肌细胞严重受损，肌小节蛋白a-Actinin染色显示心肌纤维骨架断裂，呈颗粒状。见表1及图2。

表1　不同浓度盐酸克伦特罗对心肌细胞大小和搏动频率

注：与对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

2.4　不同浓度盐酸克伦特罗对心肌细胞搏动频率的影响

对照组中，iPSC-心肌细胞的博动频率约60次/min,与人类正常心肌搏动频率相近。不同浓度盐酸克伦特罗作用后，各组iPSC-心肌细胞搏动频率迅速加快，最高达105次/min，均与对照组有统计学差异(P<0.05)。而且表现出随着盐酸克伦特罗浓度增加，细胞博动频率明显加快的趋势。见表1。

图3　心肌细胞凋亡检测的流式细胞图

2.5　不同浓度盐酸克伦特罗对心肌细胞凋亡率的影响

10μg/ml组和50μg/ml组iPSC-心肌细胞凋亡率均明显高于对照组，差异有统计学意义(t值分别为4.57、10.27，P<0.01)。见表2和图3。

表2　不同浓度盐酸克伦特罗对心肌细胞

注：与对照组比较，1)P<0.01

[本文图1、图2见插3和插4]

3讨论

本文结果表明，各种浓度盐酸克伦特罗均可使心肌细胞缩小，高浓度盐酸克伦特罗(50μg/ml-100μg/ml)可导致心肌纤维骨架断裂，这种形态结构变化可能是盐酸克伦特罗通过下调基质金属蛋白酶-9(MMP-9)信号通路活性，使细胞外基质中胶原蛋白变性、降解所致[10]。

已有报道，盐酸克伦特罗作为β2-肾上腺素受体激动剂，能够提高大鼠心肌细胞内质网内钙离子(Ca2+)浓度，引起钙瞬变，使心肌肌浆网Ca2+-ATP酶2(SERCA2a)和Na+/Ca2+交换体过表达，刺激心肌细胞收缩[11],并使心肌重链亚型由慢性I型向快性II型转变[12]，从而引起心肌细胞搏动频率增加。本研究观察到了与此相一致的现象，且发现心肌细胞搏动频率随盐酸克伦特罗浓度升高而加快，表明盐酸克伦特罗对心肌细胞有正性频率作用。但Siedlecka等[13]采用高剂量盐酸克伦特罗(800μg/ml)作用于家兔心肌细胞，结果显示其能激活家兔心肌细胞Gi蛋白，降低cAMP活性，减少钙瞬变及L型钙电流，从而减缓心肌细胞收缩，降低心肌细胞搏动频率。上述结果提示不同剂量盐酸克伦特罗对不同作用对象的心肌细胞搏动频率的影响存在差异，这种差异的原因和作用机制还需要进一步探讨。

盐酸克伦特罗主要是通过激活细胞表面磷脂酰丝氨酸激酶Caspase3来提高心肌细胞DNA的热敏感性，从而使双链变性断裂，导致心肌细胞凋亡，在Burniston等[14]的实验中，盐酸克伦特罗引起家兔心肌细胞凋亡的最低浓度为1mg/kg,即1ng/ml作用2h，细胞即开始凋亡。本文采用10μg/ml盐酸克伦特罗干预12h后，心肌细胞凋亡率达14.80%，50μg/ml达24.6%，表明一定浓度盐酸克伦特罗有诱导人类iPSC-心肌细胞凋亡的作用。

综上所述，盐酸克伦特罗对人类iPSC-心肌细胞有一定毒性作用。尽管目前未能了解一般人群体内残留的瘦肉精含量及其对人体的危害程度，但瘦肉精对心血管系统的损害，应该引起全社会的重视和广大科研工作者的深入研究，共同保障国人食品安全。

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杨慧(1990-)，女，汉族，硕士研究生，研究方向：iPSC与心肌组织工程

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14Burniston J, Tan L, Goldspink D, et al. 2-Adrenergic receptor stimulation in vivo induces apoptosis in the rat heart and soleus muscle[J]. Journal of Applied Physiology, 2005，98(4):1 379-1 386.

作者简介：本文第一

[中图分类号]R337

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2015)04-0015-05

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．005

本文2015-05-04收到，2015-09-02修回

微循环学杂志，2015，25（4）：15－18，24

© 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION