辅助型T细胞9对动脉粥样硬化斑块的影响

杨克平　张云峰　倪文琼　许臣洪　李　欣

辅助型T细胞9对动脉粥样硬化斑块的影响

杨克平张云峰倪文琼许臣洪李欣

【摘要】目的：探讨辅助型T细胞9(Th9)对动脉粥样硬化斑块形成的影响。方法：8周龄载脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠28只，4只用作制备Th9细胞，余24只分为四组：高脂喂养至12周龄组和16周龄组，Th9过继组(尾静脉注射Th9)和白细胞介素-9抗体(IL-9 Ab)组(尾静脉注射IL-9 Ab)，每组6只。分别用流式细胞术及ELISA计数12周龄组和16周龄组小鼠外周血Th9细胞和检测IL-9水平变化，同时HE染色观察两组腹主动脉斑块面积及其与管腔面积的比值；16周时用相同方法检测Th9过继组和IL-9 Ab组上述指标，并行两组腹主动脉CD68免疫组化(SP法)染色，比较CD68阳性细胞数量差异。结果：16周龄组小鼠外周血Th9细胞计数及IL-9水平均较12周龄组升高，腹主动脉斑块面积和斑块面积/管腔面积比值也增大，差异均有统计学意义(P<0.05)；与IL-9 Ab组比较，Th9过继组外周血Th9细胞数量及IL-9浓度均上升，腹主动脉斑块面积和斑块面积/管腔面积比值明显增大，斑块内CD68阳性细胞增多，纤维帽厚度变薄，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：Th9细胞可能通过IL-9促进斑块形成，并可能是斑块不稳定的重要因素。

【关键词】辅助型T细胞9；白细胞介素-9；动脉粥样硬化；apoE-/-小鼠

Effect of Helper T cell 9 on the Formation of Atherosclerosis Plaque

YANG Ke-ping, ZHANG Yun-feng，NI Wen-qiong，XU Chen-hong，LI Xin

Department of Cardiology, Jingzhou Central Hospital, Jingzhou 434020,China

【Abstract】Objective: To explore the effect of Helper T cells 9(Th9) on the formation of atherosclerosis plaque. Method: 28 apolipoprotein E gene knockout (apoE-/-) mice of 8 weeks of age were fed with high fat diet. 4 mice was used for preparation of Th9 cells, the rest 24 were divided into four groups: 12 weeks of age group and 16 weeks of age group and Th9 adoptive group (injection of Th9 via tail vein) and IL-9 Ab group (injection of IL-9 Ab via tail vein). Each group contained 6. Flow cytometry and ELISA assay were used to detect the changes of Th9 cell count and IL-9 level in peripheral blood of 12 and 16 week old mice, and HE staining was used to observe the area of abdominal aortic plaque and the ratio of the size of the abdominal aorta to the lumen area. The same method was used to detect the above indexes of Th9 and IL-9 Ab groups in 16 weeks. CD68 immunohistochemical (SP) staining was performed to compare the number of CD68 positive cells in the two groups. Results: The peripheral blood Th9 cells and IL-9 levels of 16 weeks old apoE-/-mice were higher than those of the 12 week old mice. The area of abdominal aortic plaque and plaque area / lumen area ratio also increased. The differences were statistically significant (P<0.05); comparison of Th9 adoptive group and IL-9 antibody group, Th9 cells quantity in peripheral blood and IL-9 concentration of the former increased, abdominal aortic plaque area and plaque area / lumen area ratio increased significantly, CD68 positive cells increased in the plaque, the thickness of fibrous cap became thin, the differences were statistically significant(P<0.05). Conclusion: Th9 cell could boost atherosclerosis and contribute to unsteady state of artery plaque via IL-9.

【Key words】Helper T cell 9; IL-9; Atherosclerosis; apoE-/-mouse

冠心病病程与血管壁急慢性炎症有关。生物体内各种T细胞亚群均参与了炎症过程，对其干预已成为预防和治疗冠心病研究的热门方向。近年研究发现的辅助型T细胞9(Helper T cell 9，Th9)是一种新型效应性细胞，它不同于以往的Th1、Th2、Th17

和调节性T细胞(Treg)亚类，Th9以分泌白细胞介素-9(IL-9)为主，并在多种免疫性和过敏性疾病中发挥重要作用[1]。但其是否参与动脉粥样硬化的血管壁炎症反应及对动脉粥样斑块的作用机制尚不十分明确。本实验观察载脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠经高脂饲料喂养不同时间或尾静脉注射一定剂量Th9或IL-9干预后，小鼠周围血Th9、IL-9水平及腹主动脉粥样斑块面积、纤维帽厚度、CD68阳性巨噬细胞数量等的变化，探讨Th9对动脉粥样硬化形成和发展的影响。

1材料与方法

1.1　实验动物及分组处理

8周龄雄性apoE-/-C57BL/6J小鼠28只，购自北京维通利华实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2014-0008；4只用作制备Th9细胞，余24只随机分为四组：12周龄组6只，高脂饮食(脂肪15.00%、胆固醇1.25%、胆酸0.50%、基础饲料83.75%，购自江苏协同生物工程有限公司)喂养至12周龄时，取外周血及腹主动脉检测有关指标；16周龄组6只，高脂饮食喂养至16周龄时，取外周血及腹主动脉检测有关指标；Th9过继组6只，每只8周龄小鼠尾静脉一次性注射1.3中制备的同系小鼠CD4+IL-9+T细胞(Th9细胞)3×106个，16周龄时取外周血及腹主动脉检测有关指标；IL-9抗体组(IL-9 Ab组)6只，每只8周龄小鼠尾静脉注射IL-9 Ab，每周一次，5μg/次，16周龄时取外周血及腹主动脉检测有关指标。

1.2　实验试剂和器材

rmIL-4和rmTGF-β购自美国 Biosource公司(NO:BML-P150-0500)； FITC-antimouse CD4、PE-anti mouseCD62L及PE-anti IL-9 购自美国Biolegend 公司(NO:108909)；IL-9 ELISA试剂盒购自美国R&D公司(NO:SC1375)；CD68单克隆抗体和SP试剂盒购自上海迈新生物技术有限公司(NO:FX-00013)；细胞培养基包含RPMI 1640(Gibco公司,NO:31800022)和20%胎牛血清(Gibco公司，NO: 16000085),青霉素和链霉素各100U/L(上海生物化学制药厂，NO: 20140718)；固定剂、破膜剂购自美国Beckman-coulter公司(NO:92550-00-35)；Tris-NH4Cl购自上海君瑞生物技术有限公司(NO:UFJ00341)；PBS购自上海研拓生物技术有限公司(NO:H0042)；CD3Ab、CD28Ab培养板购自美国BD公司(NO:553057)；乌拉坦购自上海恒远生物科技有限公司(NO:51796)。实验器材：恒温培养箱(9082型，上海医用分析仪器厂)；EL312 microplate 酶标仪(BIO-TEK，美国)；96孔聚苯乙烯酶标板(655096型，德国Greiner )；石蜡病理切片机(YD-325型，上海之信仪器有限公司)；显微摄像系统( BX50，日本Olympus公司)；流式细胞仪(FACSCanto，美国Becton Dickinson公司)。

1.3　Th9细胞的制备

8周龄雄性apoE-/-小鼠4只，乙醚麻醉后剖腹取脾脏，研磨过滤，Tris-NH4Cl去除红细胞，收集有核细胞用PBS调整密度为106个/ml，制成每管100μl细胞悬液共4支，分别加入标记FITC-CD4、PE-CD62L各0.1μg, 4℃ 孵育20min后，PBS洗两遍；加入0.5ml PBS重悬，流式细胞仪分选CD4+CD62LhighT细胞作为naive T细胞。用RPMI重悬naive T细胞浓度为2×106个/ml，加至2μg/ml CD3 Ab和CD28 Ab包被过夜培养板，再每孔加入20ng/ml的rmIL-4和3ng/ml 的转化生长因子-β(TGF-β)溶液，37℃ 孵育48h收获细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，加入FITC-CD4和PE-IL-9抗体，用流式细胞术检测到CD4+IL-9+细胞即为Th9细胞。结果显示，CD4+IL-9+T细胞占细胞总数(74±12)%，见图1。

图1　Th9细胞(CD4+IL-9+ )流式细胞图

1.4　有关指标及检测方法

1.4.1Th9细胞检测：眼球摘除法取各组小鼠外周血200μl，肝素抗凝，用同1.3方法制作有核细胞悬液，每管100μl。用FITC-CD4+抗体10μl标记，4℃避光孵育30min。随后进行细胞固定、破膜和胞内

染色，即每管中加入PE-anti IL-9 10μl，4℃避光孵育25min，PBS洗涤后，1 500r/min离心5min，弃上清，重洗一遍后，上流式细胞仪检测Th9细胞数量。以Th9细胞占有核细胞百分比表示。

1.4.2IL-9检测：眼球摘除法取各组小鼠外周血，肝素抗凝，离心留取血浆，置于-80℃冰箱中冻存，按ELISA试剂盒说明书检测IL-9浓度。

1.4.3腹主动脉斑块观察：各组小鼠腹腔注射10%乌拉坦麻醉后剖腹，取整段腹主动脉，用4.0g/L多聚甲醛固定10min,常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察，通过Image J软件分析计算腹主动脉斑块面积与管腔面积、两者面积比及纤维帽厚度。

1.4.4腹主动脉斑块CD68染色：取Th9过继组和IL-9 Ab组小鼠腹主动脉组织斑块，采用SP法，参照试剂盒说明书行腹主动脉斑块CD68染色，以每张切片斑块肩部及基底部出现黄色或棕黄色颗粒为CD68阳性细胞，选取4个高倍视野(×200)计数每个视野中的阳性细胞，取均值进行统计学分析。

1.5　统计学处理

2结果

2.1　不同周龄apoE-/-小鼠外周血Th9细胞数量、IL-9浓度变化及腹主动脉斑块大小

16周龄组小鼠外周血Th9细胞数量及IL-9浓度较12周龄组小鼠升高(t=3.217，t=3.341，P<0.05)；腹主动脉斑块面积及斑块面积/管腔面积比值亦比12周龄组大(t=5.426，t=6.324，P<0.05)，斑块内细胞丰富，胆固醇结晶增多，纤维帽较薄(t=4.100，P<0.01)；两组管腔面积差异无统计学意义(t=2.118，P>0.05)。见表1和图2。

表1　不同周龄小鼠外周血中Th9数量、IL-9浓度及腹主动脉

注：与12周龄组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

2.2　Th9过继组和IL-9 Ab组外周血Th9细胞数量、IL-9浓度变化及腹主动脉斑块大小

16周龄Th9过继组小鼠外周血Th9细胞计数和IL-9浓度均较IL-9 Ab组增加(t=6.214，t=6.248，P<0.01)，且腹主动脉斑块较IL-9 Ab组明显增大(t=5.302，P<0.01)，其占管腔面积比更大(t=7.438，P<0.01)；纤维帽更薄(P<0.01)；两组管腔面积差异无统计学意义(t=1.872，P>0.05)。见表2及图3。

表2　Th9过继组和IL-9 Ab组小鼠外周血Th9细胞计数、IL-9

注： 与IL-9 Ab组比较，1)P<0.01

2.3　Th9过继组和IL-9 Ab组大鼠腹主动脉斑块CD68免疫组化结果

如图4所示，16周龄Th9过继组小鼠腹主动脉斑块内CD68阳性巨噬细胞显著多于IL-9 Ab组，其值分别为52±12和24±8(n均=6)，差异有统计学意义(t=3.700，P<0.05)。

[本文图2-图4见封4]

3讨论

动脉粥样硬化与血管壁内慢性炎症有关，在动脉粥样损害的早期阶段即有活化的T淋巴细胞在斑块局部浸润。除了经典辅助性T细胞Th1、Th2，近年对Th17和Treg与动脉粥样硬化的研究也较多[2,3]，认为Th17细胞以促炎作用为主，而Treg对斑块有明显抑制作用。最近又有研究发现机体内有一群不同于上述辅助性T细胞的CD4+T细胞亚群，主要分泌IL-9，称之为Th9[4]。在体外，此类细胞可通过IL-4和TGF-β诱导naive T细胞而获得[5]。目前研究表明，Th9细胞在寄生虫诱发的免疫应答和过敏性疾病中起着重要的作用，其主要效应因子是IL-9[6,7]。在自身免疫性结肠炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、多发性硬化等自身免疫性疾病中，Th9细胞能加重炎症反应而加重病情[8-10]。但Th9是否参与动脉粥样硬化的炎症过程，对斑块生长的作用如何尚不十分明确。因此，本研究采用高脂饮食饲养8周龄apoE-/-小鼠，分别给予Th9过继及IL-9 Ab干预后，观察Th9细胞过继在动脉粥样硬化炎症过程中的作用。

本文结果表明，经高脂饮食喂养的8周龄apoE-/-小鼠，其外周血中Th9细胞数量及IL-9浓度均明显升高，斑块面积也增大，提示Th9可能通过IL-9促进小鼠炎症的发生，进而导致动脉粥样硬化。为了验证该现象，我们给apoE-/-小鼠注入Th9细胞(过继组)或IL-9抗体，结果再次表明Th9过继组Th9细胞数量和IL-9水平均高于IL-9 Ab组，且斑块面积更大，纤维帽更薄，斑块内巨噬细胞增多，而IL-9 Ab组由于IL-9 Ab中和了IL-9的作用，上述指标明显改善，且CD68阳性巨噬细胞也显著减少，进一步证实Th9细胞分泌的IL-9参与和促进了动脉粥样硬化的炎症过程，更在斑块的不稳定性中充当重要角色。

既往认为IL-9是Th2细胞类因子，与个体发育及造血有关，但近来研究发现， IL-9可作用于多种炎症细胞，远远超出了仅仅作为调节造血细胞的阀功能[11]。有文献报道过敏性哮喘及鼻炎患者血清IL-9水平升高[12,13]。还有研究认为IL-9可作为调节自身免疫性疾病炎症反应的一种新的治疗靶向，可用 IL-9 Ab来治疗某些哮喘、粒细胞性白血病和关节炎等免疫性疾病[14-16]。本次动物实验证实Th9细胞积极参与了动脉粥样硬化的炎症机制，对动脉硬化有明显促进作用。另一方面，IL-9 Ab可抑制炎症进程和改善动脉粥样硬化，提示临床这种炎症机制调节或可作为预防和治疗冠心病的靶标之一。但对Th9是否通过IL-9途径来聚集巨噬细胞，从而激发炎症反应，形成斑块泡沫化，有待进一步研究。

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杨克平(1977—)，男，汉族，博士，副主任医师，主要从事冠心病炎症机制研究

参考文献

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作者简介：本文第一

[中图分类号]R392.12

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2015)04-0032-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．008

[作者单位]湖北省荆州市中心医院心内科，荆州 434020

本文2015-05-20收到，2015-09-21修回

微循环学杂志，2015，25（4）：32－35

© 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION