脂多糖致脓毒血症大鼠血管内皮细胞凋亡的实验观察*

周　荣　丁晓莉　刘良明

脂多糖致脓毒血症大鼠血管内皮细胞凋亡的实验观察*

周荣丁晓莉刘良明#

【摘要】目的：观察细菌脂多糖(LPS)致脓毒血症大鼠血管内皮细胞(VEC)凋亡的器官靶向性及时相性特征。方法：70只SD大鼠经尾静脉一次性注射LPS(10mg/kg)复制脓毒血症模型后平分为30min组、1h组、2h组、4h组、8h组、16h组和24h组。另选10只SD大鼠作为正常对照组。眼眶采血，ELISA检测各组血清中血管性血友病因子(vWF)及炎性介质白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化特征。断头处死对照组、1h组、4h组和8h组大鼠，取肺、肝、心、脑、肾制作组织切片，采用地高辛标记凋亡细胞，免疫组化染色检测上述各组大鼠各脏器VEC凋亡。结果：2h-24h组TNF-α浓度均较对照组升高，4h组达峰值(P<0.01)；IL-1β在2h组和4h组显著高于对照组，2h组为峰值(P<0.01)，8h-24h组与对照组无显著差异(P>0.05)。4h-8h组大鼠血清vWF浓度较对照组升高，4h组达峰值(P<0.05)，其它时相组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。LPS致脓毒血症大鼠肺、肝、心、脑、肾存在不同程度VEC凋亡现象，其中肺部受累较早。结论：LPS(10mg/ml)所致脓毒血症大鼠重要脏器可出现VEC凋亡，以肺部较早。

【关键词】脂多糖；脓毒血症；内皮细胞；凋亡；大鼠

Observation of Vascular Endothelium Cell Apoptosis in Endotoximia Rat induced by LPS

ZHOU Rong, DING Xiao-li, LIU Liang-ming#

State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, The 2ndDepartment of Research Institute of Surgery, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China；#Corresponding author

【Abstract】Objective: To evaluate vascular endothelium cell (VEC) apoptosis and its characteristics in lipopolysaccharide (LPS) induced endotoxic model in rat. Method: LPS (10mg/kg) was administered in one bout via caudal vein in 70 rats and then divided randomly into LPS-administered after 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 16h, and 24h group. Another 10 rats was adopted as control group. Blood was collected from orbit. The concentrations of von Willebrand factor (vWF) and interleukin 1β (IL-1β) and tumor necrosis factor α (TNF-α) were detected by ELISA. Rats were sacrificed by decaptitation. The tissue of heart, liver, brain, kidney, lung were collected and made tissue slice. VEC apoptosis of these organs was evaluated with immunohistochemisty staining labeled with digoxin dUTP after LPS was administered. Results: The concentration of TNF-α in serum increased in LPS- administered 2h-24h group compared with the control group, and peaked at 4h group (P<0.01). The concentration of IL-1β in serum also increased in LPS- administered 2h-4h group, peaked at 2h group (P<0.01), and there were no significant difference between 8h-24h and control group respectivly (P>0.05).The concentration of vWF in serum enhanced gradually after LPS in LPS-administered 2h-8h group, peaked at 4h group (P<0.05), decreased in 16h and 24h group compared with 4h group (P<0.05). The apoptosis of VEC from vital organ (lung, heart, brain, kidney and

[作者单位]第三军医大学第三附属医院野战外科研究所第二研究室，创伤、烧伤及复合伤国家重点实验室，重庆 400042；#通讯作者,Tel：023-68757421；E-mail：liuliangming@yahoo.com

本文2015-07-09收到，2015-09-06修回

liver) occurred after LPS administered for 2-4h, and lung was the most early organ involved. Conclusion: VEC apoptosis occurred in LPS (10mg/ml) induced endotoximia in rat, and lung is the much earlier organ involved.

【Key words】Lipopolysaccharide (LPS)； Endotoximia；Vascular endothelial cell (VEC)；Apoptosis；Rat

血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell, VEC)是各种伤害性刺激(如组织缺血/再灌注、感染等)最先侵犯的部位，是介导脓毒症/脓毒性休克等临床重症发生发展的关键细胞之一[1]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作为革兰阴性菌细胞壁的主要成分，可激活机体炎症反应。LPS通过Toll样受体4/2 (TLR4/2)介导的信号转导系统，促进核转录因子-κB(Nuclear Transcriptional Factor-κB，NF-κB)的核移位及炎性介质白介素-1β(Interleukin 1β， IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)等的合成、释放，由一系列信号传导过程引起机体循环血中炎性细胞(如中性粒细胞)及VEC的激活，诱导细胞凋亡的发生[2,3]。VEC凋亡是脓毒血症的一个重要病理环节。动物实验表明，血管内注射内毒素能引起微血管内皮损害和VEC脱落[4]；临床脓毒血症患者外周血中不但可检测到脱落的内皮细胞，且其增加程度与患者死亡率密切相关[5]。这些资料表明，脓毒血症时VEC凋亡和脱落可能与脓毒症所致微血管渗漏、组织水肿及器官功能衰竭的发生密切相关，其在脓毒症的发展演变中起着重要作用。本研究经大鼠尾静脉注射LPS致脓毒血症模型，观察制模后不同时间实验大鼠外周循环血中炎性介质指标(TNF-α、IL-1β)和血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)水平的变化及不同脏器(肺、肝、心、脑、肾)组织中VEC凋亡现象，初步评价经静脉注射LPS致大鼠脓毒血症时VEC凋亡的发生规律。

1材料与方法

1.1　实验动物和试剂

1.1.1实验动物： 清洁级SD大鼠80只(200-220g)，雌雄不限，由第三军医大学第三附属医院野战外科研究所实验动物中心提供(动物合格证号：SYXK2002-032)。

1.1.2实验主要试剂：LPS(O111∶B4)购自美国Sigma公司(批号：114M4009V)，实验时用生理盐水溶解。细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(批号：MK1023)，大鼠TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司(批号：002859、028514)；大鼠vWF ELISA试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司(批号：REV002)；其它试剂均为国产分析纯。

1.2　复制大鼠脓毒血症模型及分组处理

取70只SD大鼠，实验前禁食1h，自由进水。实验当日经尾静脉一次性注射LPS(10mg/kg)复制大鼠脓毒血症模型[6]，随机平分为LPS 0.5h、1h、2h、4h、8h、16h和24h组。另取10只大鼠经尾静脉注射相同体积灭菌生理盐水(对照组)。

1.3　样本采集

各组大鼠经眼眶取血1ml后，颈椎脱臼处死，迅速摘取对照组、1h组、4h组和8h组大鼠心、肝、肺、脑及肾组织。为避免灌注可能带来的血管内皮损伤，以上脏器均不进行灌注冲洗。所有脏器均快速取出并放入预冷生理盐水中。心脏组织选取左心室，沿最大纵断面取材；肝脏选肝右叶纵断面取材；肺脏选取左肺纵断面取材；脑组织选左侧大脑，纵断面取材；肾脏选右肾，纵断面取材。制成组织块(厚约2mm)。组织块在冰浴中清洗后，置4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片(5μm)。

1.4　ELISA检测TNF-α、IL-1β及vWF浓度

各组大鼠眼眶取血离心后收集血清，严格按照各指标试剂盒说明书进行操作。

1.5　原位末端标记法(TUNEL)检测血管内皮凋亡细胞

取制备好的各组各脏器组织病理切片，采用生物素标记的地高辛抗体联合链酶亲和素-荧光素FITC标记DNA断裂片段的3’-OH末端，检测凋亡VEC。操作按试剂盒说明书进行，用 PBS 缓冲液代替一抗作阴性对照，荧光显微镜下凋亡VEC呈黄绿色荧光颗粒。

1.6　统计学处理

2结果

2.1　各组大鼠TNF-α和 IL-1β血清水平变化

各组TNF-α和 IL-1β水平差异有统计学意义(F=6.372、6.138，P<0.01)。与对照组比较，2h-24h组大鼠血清TNF-α水平显著升高，4h组为峰值(t均>2.074，P<0.01)，见图1。2h组、4h组大鼠IL-1β浓度较对照组显著升高，2h组为峰值(t均>2.283,P<0.01)；8h-24h组与对照组比较无显著性差异(t均<1.136，P>0.05)。见图2。

注：与对照组比较，*P<0.01

注：与对照组比较，*P<0.01

2.2　各组大鼠血清vWF水平变化

各组大鼠血清vWF水平差异有统计学意义(F=6.439，P<0.05)。与对照组比较，4h组和8h组vWF浓度升高(t值分别为2.173和1.969，P<0.05)，4h组达峰值。0.5h组、1h组、2h组、16h组和24h组与对照组差异无统计学意义(t均<1.098，P>0.05)。见图3。

注：与对照组比较，*P<0.05

2.3　各组大鼠各脏器VEC凋亡情况

图4显示，对照组各脏器均未见凋亡VEC。1h、4h和8h组大鼠左肺组织肺泡壁VEC均见黄绿色荧光颗粒，并随着时间延长，肺泡壁增厚，间质水肿，炎性细胞浸润；4h和8h组大鼠右肝组织VEC亦呈黄绿色荧光染色，但肝血窦间隙未见增加，无明显组织水肿；8h组大鼠左心肌组织可见VEC凋亡，且心肌细胞间隙增加，炎性细胞浸润；4h和8h组大鼠左脑组织间隙增加，可见VEC凋亡；8h组大鼠右肾组织肿胀，组织间隙增加及水肿，亦见凋亡VEC。

[本文图4见插2]

3讨论

LPS是革兰阴性细菌胞壁中的一种成分，是导致严重创伤后全身炎性反应综合症、器官功能衰竭发生及机体死亡的常见原因[7]。VEC作为覆盖在循环系统内部的单层细胞，在血管舒缩功能的调节、营养物质的转运、血液流动性的维持及脏器组织血供的保障中发挥重要作用。脓毒血症时，VEC凋亡可引起血管舒缩功能失调、组织水肿及组织供血不足等多种并发症的发生。

目前采用的大鼠脓毒血症模型通常是盲肠结扎穿孔。本实验采用大鼠经尾静脉一次性注射LPS(10mg/kg)所致脓毒血症，观察其对重要脏器VEC凋亡的影响。结果显示，LPS注射2h后，大鼠血清炎性因子 TNF-α和IL-1β水平较对照组升高，提示LPS(10mg/kg)经尾静脉注射可诱导大鼠脓毒血症发生，其中TNF-α升高时间持续更长，可以作为提示脓毒症发生较敏感的指标。

基础研究表明，脓毒血症患者血清vWF浓度升高[8]，且与VEC功能异常及患者预后关系密切[9]；急性肺损伤患者早期血清vWF浓度升高，且与病死率成正比[10，11]。本实验结果表明，与对照组比较，LPS注射后4-8h，大鼠血清vWF显著升高，16-24h降低至对照组水平；各组大鼠肺、心、肝、肾、脑组织的VEC均在不同时相发生不同程度凋亡(呈黄绿色荧光颗粒)，且多数器官出现相应的细胞或组织间隙肿胀。其中肺是较早受累的器官。

综上，经尾静脉注射LPS可诱导大鼠脓毒血症及VEC凋亡，引起血管内皮通透性增加和组织水肿。提示在脓毒血症早期干预VEC凋亡的发生，对防治严重创伤后血管渗漏、组织水肿及器官功能衰竭有重要意义。

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周荣(1971-)，女，汉族，医学博士，副研究员，研究方向为休克血管功能障碍发生机制及防治

参考文献

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4Cybulsky MI, Chan MK, Movat HZ. Acute inflammation and microthrombosis induced by endotoxin, interleukin-1, and tumor or necrosis factor and their implication in gramnegative infection[J]. Lab Invest,1988,58(4):365-378.

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8姜福富，覃钢，韦柳青，等.连续性静脉血液滤过对脓素症患者内皮功能的作用[J].实用临床医学杂志，2011，15(23)：21-23.

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作者简介：本文第一

*[基金项目]重庆市自然科学基金重点项目资助课题(CSTC2009BA5018)

[中图分类号]R363.1+4

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2015)04-0007-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．002

微循环学杂志，2015，25（4）：7－10

© 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION