创伤后应激障碍对大鼠肠系膜和软脑膜微循环的影响*

刘　蜜　宋丹丹　李玉珍　徐菲菲　陶天琪　李　冬　刘秀华　郭渝成

guoyucheng717@163.com

创伤后应激障碍对大鼠肠系膜和软脑膜微循环的影响*

刘蜜宋丹丹李玉珍徐菲菲陶天琪李冬刘秀华郭渝成#

guoyucheng717@163.com

【摘要】目的：研究创伤后应激障碍 (PTSD) 大鼠肠系膜和软脑膜微循环的改变及其机制。方法：成年健康雄性SD大鼠18只，随机分为正常对照组 (n=6) 和PTSD组 (n=12)。采用单程延长刺激法复制PTSD大鼠模型，通过旷场实验检测大鼠的行为学改变；采用活体微循环观测技术观察大鼠肠系膜及软脑膜微血管内径和血流速度的改变；采用ELISA检测大鼠血浆去甲肾上腺素 (NA)、内皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 和内皮素-1 (ET-1)水平。结果：与正常对照组比较，PTSD组大鼠在旷场中穿行格数及直立次数显著减少 (P<0.01)；肠系膜及软脑膜细动脉、细静脉管径明显变细(P<0.05)，血流速度趋缓；血浆NA和ET-1含量显著升高 (P<0.01)，但eNOS水平无显著变化 (P>0.05)。结论：PTSD大鼠存在肠系膜和软脑膜微循环障碍。

【关键词】创伤后应激障碍；肠系膜；软脑膜；微循环；大鼠

Post-traumatic Stress Disorder on the Microcirculation of Mesentery and Cerebral Pia Mater in Rats

LIU Mi, SONG Dan-dan, LI Yu-zhen, XU Fei-fei, TAO Tian-qi, LI Dong, LIU Xiu-hua, GUO Yu-cheng#

Department of Pathophysiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China；#Corresponding author

【Abstract】Objective: To investigate the effect of post-traumatic stress disorder (PTSD) on microcirculation of mesentery and cerebral pia mater in rats and the underlying mechanisms. Method: Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into two groups: control group (n=6) and PTSD group (n=12). The PTSD model was replicated by using the single prolonged stress method. On the 14th day post-stress, the changes of animals' behavior was evaluated via open-field; the microcirculation of mesentery and cerebral pia mater of rats was observed using the microscope; the plasma noradrenaline (NA), endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and endothelin-1 (ET-1) were measured by using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results: Compared with the control rats, the numbers of crossing and rearing of the PTSD rats were decreased significantly in the open-field (P<0.01); the diameters of arteriole and veinule in the mesentery and cerebral pia mater from the PTSD rats were significantly thinner (P<0.05), the blood flow velocity showed the trend of slowed down; the plasma levels of NA and ET-1 were elevated significantly (P<0.01); there was no significant difference in the plasma level of eNOS (P>0.05).Conclusion: PTSD induces microcirculation dysfunction in mesentery and cerebral pia mater in rats.

【Key words】Post-traumatic stress disorder; Mesentery; Cerebral piamater; Microcirculation;Rat

创伤后应激障碍 (Post-traumatic Stress Disorder, PTSD) 指个体由于经历对生命具有威胁的事件或严重创伤 (如战争、自然灾害及性侵害等)，导致一系列精神症状长期存在的精神障碍，被认为是心血管疾病的独立危险因素[1-3]；微循环是心血管系统的重要组成部分，微循环障碍与心血管疾病的发生、发展和预后密切相关。PTSD与微循环的关系已受到临床应用研究的关注。

血管内皮损伤及功能障碍是心血管病的始动环节之一[4]。心理应激及精神抑郁可能导致内皮功能障碍，从而介导心身疾病的病理生理过程，包括微循环障碍。已有研究表明，来自工作及生活的压力可使内皮标志分子血管细胞黏附因子-1和可溶性细胞间黏附因子-1血浆水平显著增加[5]；以及抑郁症患者肱动脉血流介导性舒张功能降低[6]。但有关PTSD是否通过损伤血管内皮引起微循环障碍的直接证据尚未见报道。

本研究采用单程延长刺激 (Single Prolonged Stress, SPS)法模拟PTSD[7, 8]，活体观察实验大鼠自发性活动的行为学特征；活体观测肠系膜、软脑膜微血管内径和血流速度变化及离体血液中去甲肾上腺素 (Noradrenaline, NA)、内皮型一氧化氮合酶 (Endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS) 和内皮素-1 (Endothelin-1, ET-1) 水平，初步探讨PTSD对大鼠微循环的影响及其作用机制。

1材料与方法

1.1　实验动物

成年雄性SD大鼠18只，体重200-250g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。光亮/黑暗周期为12h/12h，光照时间7∶00-19∶00，环境温度为22-24℃，相对湿度50%-60%。实验前适应性喂养1周，6只/笼，自由摄食饮水。

1.2　器材与试剂

自制旷场实验箱(由底面为80cm×80cm、高50cm，四壁光滑的不透明塑料板制成，底面被划分成为16个20cm×20cm的等边方格)用于观察实验大鼠的自发性活动情况；自制恒温微循环观测盒；Olympus BH-2微循环显微镜购自日本Olympus公司；微循环图像分析系统购自徐州众联医疗器械有限公司；NA检测试剂盒(批号：H20150407)、eNOS检测试剂盒(批号：H20150408)、ET-1检测试剂盒(批号：H20150409)均为南京建成生物工程研究所产品；Infinite®F200 PRO多功能酶标仪为瑞士TECAN公司产品。

1.3　实验分组与PTSD处理

实验大鼠按照随机数字表完全随机化分为正常对照组(Control组，n=6)和PTSD组(n=12)，Control组大鼠常规饲养，不作任何处理。PTSD组大鼠模拟PTSD：先将大鼠置于圆锥形聚乙烯固定器中固定2h(仅尾巴可以活动)，强迫其游泳20min(游泳池长50cm，宽40cm，高60cm，水深40cm，水温24℃，每次6只)；休息15min后，将大鼠放入下层盛有100%乙醚的干燥器中麻醉(约3-5min)，取出待其自然清醒后，放回笼中无干扰常规饲养2周。

1.4　旷场实验及自发活动指标

模拟PTSD后第14天，参照文献[9]方法，在暗光、无噪声环境下，将两组大鼠依次置于旷场实验箱中，用摄像头监视大鼠活动情况，10s适应后，采集5min视频资料记录其穿行格数(三爪以上跨入临格的次数)和直立次数(两前爪腾空1cm以上或攀附墙壁次数)。

1.5　微循环观测

为降低工作量，PTSD组样本含量为9时已满足实验所需，故PTSD组只随机选择9只大鼠进行微循环观测。

1.5.1肠系膜微循环观测：两组大鼠完成旷场实验后禁食12h，以20%乌拉坦肌肉注射(0.8ml/100g)麻醉，取仰卧位固定于手术台上，于腹部正中作一长2cm纵行切口，轻轻牵出一段空肠，将肠系膜平铺于37℃恒温透明微循环观察盒中并放置于微循环显微镜载物台上，保持湿润(不时滴加37℃生理盐水)，采用高压汞灯光源和微循环显微镜观测系统观测肠系膜微血管并录像。在微循环图像分析系统中回放录像，在显示器上对细静脉和细动脉内径进行测量；之后选择细静脉，采用阴极射线管群点扫描法，先调节光点使之与血管平行并顺血流方向连续扫描，再调节其扫描速度与血流速度同步，记录血流速度。

1.5.2软脑膜微循环观测：肠系膜微循环观测完成后俯卧位固定大鼠，剪开头顶部正中皮肤，暴露颅骨，以矢状缝右3mm和冠状缝后3mm交叉点为中心，用牙科电钻打孔开颅窗(直径5mm)，小心剪开硬脑膜，暴露软脑膜，以37℃人工脑脊液棉球覆盖保温、保湿。同肠系膜观测方法观察记录软脑膜微血管内径及血流速度。

1.6　血浆NA、eNOS和ET-1水平检测

完成微循环检测后腹主动脉采血5ml置于柠檬酸钠抗凝试管中，3 000rpm离心15min，分离血浆于-80℃冰箱冻存，按照试剂盒说明书集中检测血浆NA、eNOS和ET-1水平。

1.7　统计学处理

2结果

2.1　两组大鼠自发活动指标比较

与Control组比较，PTSD组大鼠穿行格数及直立次数均显著减少(P<0.01)，见表1。

表1　两组大鼠自发活动指标比较±s)

注：与Control组比较，1)P<0.01

2.2　两组大鼠肠系膜及软脑膜微循环指标比较

Control组大鼠肠系膜及软脑膜微血管清晰，细动脉血流速度快，呈线流，细静脉呈线流或线粒流，未见红细胞聚集；PTSD组大鼠肠系膜及软脑膜细动、静脉管径显著变细，肠系膜细静脉血流速度减慢，红细胞聚集明显。见图1。

2.2.1两组大鼠肠系膜和软脑膜微血管管径：与Control组比较，PTSD组大鼠肠系膜和软脑膜细静脉、细动脉均明显变细，差异有统计学意义 (P<0.05或P<0.01)，见表2。

2.2.2两组大鼠细静脉血流速度：与Control组比较，PTSD组大鼠肠系膜和软脑膜的细静脉血流速度均有减慢趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2　两组大鼠肠系膜及软脑膜微血管管径比较 (μm, ±s)

注：与Control组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

表3　两组大鼠细静脉血流速度比较

2.3　两组大鼠血浆NA、eNOS及ET-1含量比较

与Control组比较，PTSD组血浆NA和ET-1含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)；两组间eNOS水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4　两组大鼠血浆NA、eNOS及ET-1含量

注：与Control组比较，1)P<0.01

[本文图1见插3]

3讨论

PTSD是一种灾害后精神及行为障碍，具有发病率高、病程长等特点，还会直接导致冠状动脉粥样硬化性心脏病等的发生。因其交感神经-肾上腺髓质系统持续性激活，使儿茶酚胺等持续增高，导致基础心率加快和血压升高[10, 11]。本研究通过SPS法模拟大鼠PTSD，采用旷场实验、微循环检查和血管活性指标分析，获得了PTSD大鼠微循环变化特点及其机制的有意义数据和结果，为临床应用研究提供了实验依据。

微循环是机体组织血流灌注的基本单位，又是最易损伤和发生功能障碍的特殊器官。肠系膜微循环可以反映全身微循环状况，软脑膜微循环是脑血管床的一部分，其管径及血流状态可基本反映脑微循环变化。本研究观测发现，PTSD大鼠肠系膜及软脑膜细动、静脉均较正常对照大鼠显著收缩，且血流速度减慢，肠系膜微血管内可见红细胞聚集。提示PTSD可引起大鼠肠系膜和软脑膜微循环障碍。

NA主要来自肾上腺髓质，可激活交感-肾上腺髓质系统，通过激动α受体引起肠系膜微血管收缩[12]。本研究发现，PTSD大鼠血浆NA水平升高与微血管收缩同时出现，表明高水平NA可能与PTSD大鼠肠系膜及软脑膜微血管收缩有关。

血管内皮产生的旁、自分泌物ET-1也是强烈的缩血管活性肽，广泛存在于各种组织和细胞中。尤以内皮细胞受损时合成、分泌增加[13]。谢忠明等[14]研究证实高黏血症模型兔软脑膜微血管收缩与血浆ET-1 升高有明显相关性；本实验也发现血浆ET-1水平升高的PTSD大鼠肠系膜及软脑膜微血管管径较正常对照大鼠变细。进一步提示血浆ET-1水平增加与NA水平升高一样，是PTSD大鼠微血管收缩的可能机制。eNOS增加可致一氧化氮 (NO) 水平升高，NO作为血管内皮合成、分泌的最重要的血管活性物质，具有舒张血管、抗血小板聚集、抗血管平滑肌细胞增生等作用[15]。但在本研究中未能发现PTSD大鼠血浆eNOS水平升高，即PTSD大鼠的血管舒张弹性较小。

综上所述，PTSD大鼠肠系膜和软脑膜微循环存在不同程度损害，这种微循环损害机制与其血浆NA及ET-1浓度增加有关。

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刘蜜 (1985-)，女，汉族，博士，主要从事创伤后应激障碍相关心血管疾病的研究

参考文献

1Boscarino JA. PTSD is a risk factor for cardiovascular disease: time for increased screening and clinical intervention[J]. PrevMed， 2012, 54(5): 363-364.

2Boscarino JA. Post-traumatic stress disorder and cardiovascular disease link: time to identify specific pathways and interventions[J]. Am J Cardiol， 2011, 108(7): 1 052-1 053.

3Cotter G, Milo-Cotter O, Rubinstein D, et al. Posttraumatic stress disorder: a missed link between psychiatric and cardiovascular morbidity[J]. CNS Spectr， 2006, 11(2): 129-136.

5Non AL, Rimm EB, Kawachi I, et al. The effects of stress at work and at home on inflammation and endothelial dysfunction [J]. PLoS One， 2014, 9(4):e94474.

6Mausbach BT, Chattillion E, Roepke S, et al. A longitudinal analysis of the relations among stress, depressive symptoms, leisure satisfaction, and endothelial function in caregivers[J]. Health Psychol， 2012, 31(4): 433-440.

7Yamamoto S, Morinobu S, Takei S, et al. Single prolonged stress: toward an animal model of posttraumatic stress disorder[J]. Depress Anxiety， 2009，26 (12): 1 110-1 117.

8Liberzon I, Krstov M, Young EA. Stress-restress: effects on ACTH and fast feedback[J]. Psychoneuroendocrinology，1997，22(6): 443-453.

9Avital A, Ram E, Maayan R, et al. Effects of early-life stress on behavior and neurosteroid levels in the rat hypothalamus and entorhinal cortex[J]. Brain Res Bull，2006, 68(6): 419-424.

10Buckley TC, Kaloupek DG. A meta-analytic examination of basal cardiovascular activity in posttraumatic stress disorder[J]. Psychosom Med， 2001, 63(4): 585-594.

11Orr SP, Metzger LJ, Lasko NB, et al. Harvard/Veterans Affairs Post-traumatic Stress Disorder Twin Study Investigators. Physiologic responses to sudden, loud tones in monozygotic twins discordant for combat exposure: association with posttraumatic stress disorder[J]. Arch Gen Psychiatry， 2003, 60(3): 283-288.

12Coupar IM, Mclennan PL. The influence of prostaglandins on noradrenaline-induced vasoconstriction in isolated perfused mesenteric blood vessels of the rat[J]. Br J Pharmacol， 1978, 62(1): 51-59.

13McCarron RM, Chen Y, Tomori T, et al. Endothelial-mediated regulation of cerebral microcirculation[J]. J Physiol Pharmacol， 2006, 57(11): 133-144.

14谢忠明, 曾昭炜, 马珍梅, 等. 中药清脂降黏颗粒对高黏血症兔软脑膜微血管口径的影响及血液中ET- 1 和NO含量的变化[J]. 微循环学杂志, 2005, 15(4): 35-37.

15Moncade S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology[J]. Pharmacol Rev, 1991, 43(2): 109-142.

作者简介：本文第一

[中图分类号]R331.3+5

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2015)04-0011-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．003

*[基金项目]“十二五”国家科技支撑计划项目 (2013BA108B01)；中国博士后基金 (2014M562608)

本文2015-04-30收到，2015-09-21修回

微循环学杂志，2015，25（4）：11－14

©2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION