二噁英类化合物的毒性作用机制及其生物检测方法

黄超，陈凝,2，杨明嘉,*，冯忠孚，马梅，王子健

1. 中国科学院生态环境研究中心 环境水质学国家重点实验室，北京 100085 2. 安徽省环境科学研究院，安徽 230071 3. 天津博纳艾杰尔科技有限公司，天津 300462



二噁英类化合物的毒性作用机制及其生物检测方法

黄超1，陈凝1,2，杨明嘉1,*，冯忠孚3，马梅1，王子健1

1. 中国科学院生态环境研究中心 环境水质学国家重点实验室，北京 100085 2. 安徽省环境科学研究院，安徽 230071 3. 天津博纳艾杰尔科技有限公司，天津 300462

二噁英类化合物具有高毒性，来源多样且分布广泛，是持久性有机物的典型代表，二噁英类污染物及其对健康的危害已引起了公众的普遍关注。一些二噁英类同系物具有代谢稳定性，其毒性效应主要是通过芳香烃受体介导，而越来越多的研究表明二噁英类毒性作用机制的复杂性。在此背景下，综述了近些年在二噁英类毒性作用机制及其代谢途径的新认识，评价比较了主要二噁英类高通量生物检测方法，以期为该类污染物的环境污染物筛查和风险评估提供参考。

二噁英类；芳香烃受体；毒性作用机制；代谢；生物检测

二噁英类污染物主要包括多氯二苯并-P-二噁英(PCDDs)，多氯二苯并呋喃(PCDFs)和共平面多氯联苯(PCBs)，除了具有性质稳定、长代谢半衰期和强亲脂性的特点外，在生物体内均能够作用于芳香烃受体(AhR)。二噁英类具有高毒性，来源多样且分布广泛，人类通过食物链摄取低剂量的二噁英类，并通过体内累积和富集作用，是产生健康危害的重要途径[1]。二噁英类污染及其对健康的危害已经引起了公众普遍的关注。

目前的研究指向二噁英类的毒性效应主要是通过AhR介导。然而，大量有关于AhR作用机理的研究则表明了AhR信号通路本身的复杂性[2]。 除了AhR经典信号通路，一些非经典的AhR作用模式也被不断挖掘，但当前可以肯定的是二噁英类所产生的毒性效应主要是通过AhR经典信号通路，并在基因表达水平改变而造成的。由二噁英类应答产生的细胞色素P450单加氧化酶(cytochrome P450 monooxygenases, CYPs)是其主要的代谢酶[3]，二噁英类极难代谢，能够持续的激活CYPs，直接影响细胞的代谢过程，二噁英类的代谢途径决定着这些化合物的持久性和随后的生物毒性作用[3-4]。因此基于对AhR信号通路的认识，现已开发出多种不同的二噁英类生物检测方法。这些方法通常具有高灵敏度，低成本，高通量的特点，能够快速筛查大量样品的二噁英类含量水平；还能以AhR诱导效应为终点(endpoint)，评价实际样品或未知化合物的毒性。本文就近些年有关于二噁英类的毒性作用机制和代谢过程的新进展进行综述，试图展现一个更为完整和复杂的二噁英类在体内的毒性作用模式；并综述和评价了在毒理学作用机理基础上发展的主要二噁英类高通量生物检测方法,。

1 由AhR介导的二噁英类毒性效应

1.1 二噁英类的毒性效应

二噁英类暴露以及其在生物体内的富集和累积对不同物种和组织的毒性效应是多终点的，主要的毒性作用有急性毒性、致癌性和致畸性，主要的器官毒性包括了肝毒性、皮肤毒性、内分泌毒性、生殖毒性、神经系统毒性和呼吸毒性[5]。虽然这些毒性效应与二噁英类暴露具有直接的关联，但是对其分子作用机制仍缺乏足够了解。需要指出的是二噁英类的毒性效应具有物种特异性，例如TCDD对豚鼠的急性致死毒性比仓鼠大5 000倍[6]，而人类比绝大多数物种对二噁英具有更低的敏感度[7]，不同个体之间这种敏感性也具有显著性差异[8]。但当前研究已揭示包括二噁英类在内的众多AhR配体主要通过激活或抑制AhR，从而引起了最终的生物学和毒理学效应。

1.2 AhR受体及其配体

AhR是bHLH-PAS家族中一类配体依赖性的转录激活因子，能够引起AhR应答的配体包括了内源和外源化合物，活化的AhR通过诱导和抑制生物体内一系列基因的表达而产生生物学和毒理学效应[9-10]。大量的研究已表明，在正常生理状态下下，AhR广泛参与了生物体内源性调控[11]，McMillan发现，被氧化的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)极有可能具有激活AhR的能力，这一结果暗示AhR可能参与了LDL的代谢途径[12]。虽然AhR所参与的内源性调控是一个研究热点，但目前并没有发现强亲和性的内源AhR配体，更为关注的是能够引起AhR应答并造成毒理学效应的外源化合物。在环境中广泛存在的二噁英类和芳香烃类环境污染物普遍对AhR具有强亲和性,更新的研究揭示AhR能够被其他一些不同结构的化合物所激活[11,13]。因此，不同类型的AhR配体可能对AhR的作用机制并不相同。在未来的工作中，AhR的配体结合域PAS B LBD的结构信息可能是了解这种作用机制的关键，已经解析出来的PAS家族的同源蛋白的结构信息使我们对AhR同配体的作用方式有了一定的认识[14-15]，但是目前仍然不清楚的是AhR的LBD是如何同数量庞大且结构各异的配体发生特异性结合，并且这种特异性结合是如何产生不同的生物学和毒理学效应。可以确定的是，二恶英类及其类似的外源化合物最终的毒性效应主要是通过AhR介导后，在生物体内基因表达水平的改变所引起的。

1.3 AhR分子作用机制

1.3.1 AhR的非经典信号通路

AhR经典信号通路认为AhR的激活是配体依赖的[15]，然而越来越多的研究表明了AhR介导的毒性作用机制的复杂性，其可能的作用方式包括：(1)AhR存在配体非依赖性激活途径，如依赖AhR或依赖AhR-ARNT的复合体，也可作为独立的共激活因子(coactivator)作用于其他转录激活因子(RelA)[16]，或者标记这些转录因子作为降解雌激素受体(ER)的信号[17]；(2)二噁英应答元件(DRE)并不是AhR受体唯一结合的上游应答元件。AhR通过ARNT或者其他转录激活因子二聚化后，结合在DRE替换位点上能够引起其他基因的转录激活(RelB)[18]或抑制(ER)[19]；(3)AhR能与其他转录激活因子共竞争ARNT或共激活因子，引起包括阻断ERβ转录[20]、激活其他细胞信号通路[21]等。这些非经典信号通路丰富了二噁英类等其他AhR配体所引起的毒性效应的形成途径。但总体而言，二噁英类等通过AhR非经典信号通路所贡献的毒性效应相对较小，一些针对AhR基因敲出小鼠的暴露实验研究表明，AhR经典信号通路是二噁英类等其他AhR配体产生毒性效应的主要形成途径[22]。

1.3.2 AhR的经典信号通路

二噁英类等的亲脂性使得其容易通过血清中的低密度脂蛋白转运进入细胞内与AhR相结合[22]，使得AhR体构型发生转变，使其从先前的p23、XAP2和伴侣蛋白hsp90复合体解离并激活后进入核内。此时细胞核内的芳香烃受体核转位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)与AhR异源二聚化，形成的二噁英-AhR-ARNT的复合体。这个复合体对DRE具有高度亲和性，可以作为转录激活因子在DRE处招募其他转录蛋白，引起下游序列的转录和翻译[23]。二噁英能够引起多种P450酶系中蛋白的表达，但主要是以CYP1A亚科中CYP1A1和CYP1A2协同诱导为主，普遍认为其中CYP1A1除非被诱导，否则不会在肝细胞中内源性的表达[24]。

AhR的调控存在多种途径，包括对在核内或对转运至细胞质中游离的AhR泛素化，从而引导AhR被核内或细胞质中的26S蛋白酶降解[25]。而在另一种AhR负反馈条件机制中，与AhR和ARNT同源的配体非依赖性蛋白-芳香烃抑制因子(aryl hydrocarbon receptor repressor, AhRR)，在AhR被激活后被同时表达，AhRR能够同AhR竞争结合ARNT，而AhRR缺乏转录激活域，结合在DNA上的AhRR：ARNT复合体不能引起下游基因的表达[26]。然而这两种调控途径并不能完全阻断由二噁英类等启动的AhR的信号通路。二噁英类尤其是2,3,7,8-TCDD，具有相当长的代谢半衰期[27]，能够长时间结合AhR使其活化并连续的激活下游信号通路。因此可以认为是代谢稳定AhR配体(例如二噁英类)而不是代谢不稳定的AhR配体(例如PAHs)产生了更为主要的毒性效应[2]。

2 AhR配体的代谢

外源化合物的代谢和消除决定了这些化合物在机体内的持久性和随后的生物学毒性作用[24]。大部分外源性的和内源性的AhR配体经过AhR介导产生同样经历I或II相代谢反应，这些化合物首先经过I相(Phase I)反应引入极性基团，然后I相反应产物作为II相反应的底物，被II相(Phase II)反应中的各类缀合酶等引入谷胱甘肽、硫酸酯或糖类等大分子取代基，显著的改变AhR配体的I相代谢产物的的水溶性，使其易于排出体外[3,28]。代谢的最终目的是去毒化，然而由于在I相代谢中更易生成强亲电化合物，因此相比于II相代谢，I相代谢产物更有可能形成具有毒性的活性中间物，其易于同细胞大分子发生亲核取代[29]。2,3,7,8-TCDD等具有高毒性的二噁英类化合物极难被代谢，较长的半衰期使其能持续地激活AhR，从而产生一系列相关的毒性效应。

2.1 AhR配体的I相和II相代谢

I相代谢酶CYP是AhR激动剂( AhR agonist)主要的代谢酶，可能的II代谢酶包括了谷胱甘肽转移酶、葡萄糖苷酸/硫酸根缀合酶，外源AhR激活剂的暴露通常能够引起CYP1家族CYP1A1和CYP1A2的协同表达，但Yuan等发现，在苯并[α]芘暴露下，也能引起稀有鮈鲫CYP2Y3的表达[30]。在AhR激动剂中，PAHs属于易于体内代谢的AhR激动剂，CYP1A1通常被认为是其主要代谢酶[3]。PAHs的毒性同样依赖I相代谢，其代谢活化产物才是最终的致癌剂。例如，苯并[α]芘的一种I相代谢活化产物( +)苯并[α]芘-7,8-二醇-9,10环氧物-2被认为是最活泼的致癌剂[31]。二噁英类主要被CYP1A1和CYP1A2代谢，但体内代谢过程极难进行，因此区别CYP1家族这两种酶对不同AhR激动剂的代谢活性和产物，是先前研究的关注点。Hu等[32]利用3-MC诱导SD大鼠，获得了具有CYP1A1和CYP1A2活性的SD大鼠S9馏分，实验期间通过在S9馏分中加入呋拉茶碱抑制CYP1A2活性来控制变量。该研究表明绝大多数的1-CDD和1,2,3,4-TCDD能够被CYP1A1所代谢，而2,3,7,8-TCDD和1,2,3,7,8-PCDD主要被CYP1A1所氧化。Sakaki等[33]构建了两种能够分别表达CYP1A1和CYP1A2酵母细胞，并研究了二噁英类的代谢过程。研究发现在酵母体内表达的CYP1A1和CYP1A2都能够引起2,7-diCDD和2,3,7-triCDD代谢，而CYP1A1和CYP1A2对2,3,7-trichloroDD所产生的代谢产物是不同的，CYP1A1主要的代谢产物为8-hydroxoy-2,3,7-TriCDD，而CYP1A2代谢产物更有可能是2,3,7-TriCDD的氯取代位点的羟基化产物。这些研究可能暗示CYP1家族这两种酶在结构上的细微差异导致的酶作用机理是不同的，并对其代谢的化合物具有一定的选择性。但与PAHs等其他AhR激动剂不同，PCDDs的I相代谢产物毒性相比于母体化合物显著降低，例如2,3,7,8-TCDD的一种I相代谢产物8-羟基-2,3,7-TCDD,与AhR结合能力只相当于母体的10%[34]。

AhR激动剂的I相代谢产物可被多种II相代谢酶参与进一步修饰，包括了谷胱甘肽转移酶(PCBs[35])、葡萄糖苷酸/硫酸根缀合酶(1,2,7,8-TCDD[36])等。II代谢酶对于AhR激动剂的I相代谢产物可能也具有选择性，例如谷胱甘肽转移酶主要针对于PCBs的I相代谢产物, 但目前还没有发现谷胱甘肽转移酶代谢能对PCDDs的I相代谢产物发生作用[3,34]。

2.2PCDDs的I相代谢模型

PCDDs的高毒性和代谢稳定性阻碍了对其代谢过程的研究。高毒性限制了PCDDs在模式动物中的暴露量，代谢稳定使其在先前的研究中很难得到达到仪器检测限浓度的代谢产物。尽管如此，当前的研究已表明了PCDDs的四种主要的I相代谢模型，分别是：

1. 在PCDDs的非取代位点的羟基化反应[37];

2. 在PCDDs的氯取代位点的羟基化反应[38];

3. 在二噁英环的湾区发生的开环反应[39];

4. 伴随着氯代位点转移的羟基化反应，也被称为NIH转移(NIHshift)[40]。

活体和离体代谢动力学研究已表明了一些可能的PCDDs代谢规律，例如高氯代的PCDDs(OCDD)相比于低氯代的PCDDs(1,2,3,7,8-PeCDD)更难被代谢[36]，因此Birnbaum和Couture认为C-H键对于代谢酶氧化过程是必须的[41]。这一代谢规律也被进一步验证，同时又有一些在离体实验中的证据显示相比于CYP1A1，CYP1A2更倾向于对高氯代的PCDDs(2,3,7,8-TCDD和1,2,4,7,8-PeCDD)的代谢[32]。然而这些规律并不能很好的解释2,3,7,8-TCDD所具有的强代谢稳定性。

2.3 2,3,7,8-TCDD的代谢稳定性

2,3,7,8-TCDD代谢反应更容易发生在二噁英环的湾区，并发生开环反应[39]。Suzuki[42]的量子化学分子动力学研究表明，当O2分子在高温( 472.15K)条件下作为氧化剂对2,3,7,8-TCDD发生氧化反应时，该化合物的在二噁英环湾区的C11-C12或C13-C14处更易于被活性氧氧化形成过氧化物，引发随后的开环和降解反应，并推断出PCDDs的稳定性主要跟其结构，能级和电子状态有关。

在生物体内的，2,3,7,8-TCDD代谢过程也是也更易于在二噁英环的湾区发生过氧化反应，CYP酶介导了该反应的发生，在整个反应中，结合了底物的CYPs通过NADPH-细胞色素P450还原酶，分两次接受来自NADPH所提供的共两个电子，与氧分子作用形成了酶-底物-H2O2三元复合物。该复合物在一定条件下裂解O-O键，转移了一个活性氧原子至底物，并发生歧化反应，形成氧化产物[3,24]。CYP酶的作用机制要求底物与CYP酶必须互相结合，因此CYP酶的空间结构可能影响了PCDDs的降解。现有的一些实验也证实了这种可能性的存在。Shinkyo等[33]以先前实验中证实的CYP1A1与2,3,7,8-TCDD形成结合为依据，假设若放大了大鼠CYP1A1的底物结合口袋的空间后，可以进一步增加该酶对2,3,7,8-TCDD的代谢活性，通过对定点突变技术在酵母细胞内表达CYP1A1及其突变酶，发现在该酶第240位氨基酸残基在对底物的识别具有重要的作用，得到的F240A酶能够代谢2,3,7,8-TCDD使其在氯取代位点发生羟基化作用，生成8-羟基-2,3,7-TCDD。尽管该突变酶对2,3,7,8-TCDD的代谢模式同二噁英环的湾区的开环反应有区别[39]，但使我们认识到，PCDDs的难降解与酶的底物结合口袋空间结构有直接关系。而先前有关于CYP1A1酶对PAHs代谢的研究也认为，PAHs的分子维度同CYP1A1假定的底物进口通道的空间大小可能直接影响着代谢速率的快慢,例如苯并[α]芘比苯并[e]芘更容易代谢的原因在于前者分子维度更小更容易进入假定的底物进口通道[43]。

3 二噁英类的毒性评价方法

联合毒性评估中常用的毒性当量因子( toxic equivalency factors, TEF)法是对二噁英类进行毒性评价的主要方法[44]，其主要的目的在于以一个统一的标准来对二噁英类这类化合物进行健康风险评价并对其加以监管控制。TEF法参考的毒性数据本身并不能表征二噁英类所造成的毒性和生物学效应，只是AhR激动剂对CYPs的应激，主要包括两个终点[45]：二噁英类同AhR的亲和程度和其对P4501A1的诱导能力。通过上述对AhR激动剂受体作用机理的认识，这两个终点均可以间接地表征二噁英类毒性大小。需要强调的是：TEF方法参考的活体实验的毒性数据是通过模式动物口服摄入二噁英类的来获得，只能外推应用于例如以饮食摄入为途径的人体健康风险评价，所以直接应用TEF法对土壤、沉积物和飞灰中各种二噁英类进行潜在的健康风险评价的做法原则上并不正确[45]。但是TEF制定专家组认可利用TEF法计算这些环境基质中二噁英类的总毒性当量(toxic equivalent quantity, TEQ)，并以此来表征二噁英类在这些环境基质中整体污染程度。

TEF方法目前共有两套标准，分别是1989年EPA公布的国际毒性当量因子(I-TEF)和2005年世界卫生组织(WHO)重新修订的WHO2005-TEF。TEF法以2,3,7,8-TCDD作为指标化合物(index chemical)，并将其TEF数值定义为1，以多次离体或活体实验中所得到二噁英类相对毒性当量(relative potency, ReP)数据为基础，并经过专家组判定从而确定其他不同二噁英类毒性归一化为2,3,7,8-TCDD的毒性大小。通过化学分析方法获得样品中数种二噁英类同系物浓度，再应用TEF法获得样品的TEQ。

TEF法是基于联合毒性中的剂量加合模型(dose additive model, CA)，这一模型的成立基于以多种假设，包括：二噁英同系物或结构类似物应当具有类似的浓度修饰(toxicokinetic, TK)与效应修饰(toxicodynamic, TD)方式，此外还具有相类似的剂量-效应曲线形状。 显然，这些假设条件是很难全部达到的，显示了毒性当量因子法的局限性[45]。 但是从整体来看,大部分毒性数据能够较好的验证剂量加合模型[46-48]，方法简单易行，TEF法因此得到了广泛的认可和应用。

4 基于毒性作用机理的二噁英类生物检测方法

由于二噁英类在环境介质中含量极低，其浓度检测主要依靠仪器分析方法。目前，高分辨色质谱方法仍然是二噁英类污染浓度检测的“金标准(Golden Standard)”[49]。仪器分析方法过程繁琐、检测周期长、价格昂贵，不利于开展二噁英类污染的普查或大样本量的常规监测。同时，TEF方法中得到的毒性当量同样来自对AhR激动剂活性的实验评估,因此对环境样品TEQ的估算可以直接通过生物检测方法获得。

二噁英类生物检测方法的原理基于对AhR及其信号通路的认识，以2,3,7,8-TCDD为例，其与AhR介导的P450酶系的表达过程存在着多种定量关系，是各种二噁英类生物检测定量的基础。这些定量关系包括：(1)CYP1A1表达量与2,3,7,8-TCDD暴露浓度的定量关系,(2)AhR: ARNT异源二聚体同DNA结合数量与2,3,7,8-TCDD暴露浓度定量关系。虽然AhR作用机制复杂，但是这两种定量关系在多种二噁英类生物检测方法中都体现出了较好的相关性。

4.1 基于离体细胞的生物检测方法

EROD法：由于CYP1A1酶不能由肝细胞内源表达，且CYP1A1表达量与2,3,7,8-TCDD标准品的暴露浓度存在定量关系,表达的CYP1A1酶是脱乙氧基酶，能将7-乙氧基-3-异吩噁唑酮(thoxyresorufin, ERF)转化生成荧光物质7-羟基-3-异吩噁唑酮(resorufin, RF)，正因为CYP1A1酶具有这种能力，其被称为EROD酶(ethoxyresorufin-O-deethylase)，生成的RF是荧光剂，通过检测荧光产物激发光的强度可以间接的获得样品中2,3,7,8-TCDD标准品浓度与荧光强度的剂量-效应关系[50]。高通量的EROD已建立在多种肝癌细胞系中[50-52]，其检测限范围在0.16-16 pm。虽然其他二噁英类按其TEF毒性大小换算引起的CYP1A1的表达量的定量关系并不完全等同于2,3,7,8-TCDD标准品的，但是仍然认为不同种类的的二噁英类毒性是可加的，即可以用一次环境样品中测得的荧光强度通过2,3,7,8-TCDD标准的剂量效应换算得到2,3,7,8-TCDD的浓度，并用该浓度来表示该环境样品的总毒性当量(EROD-TEQ)。然而，由ERF生成的RF荧光染料其荧光强度受pH和温度共同影响[53]，同时RF只能溶解在挥发性极强的甲醇中才能防止在室内光线下淬灭[54]，这些因素制约着EROD法的应用。

CALUX法：CALUX法全称是化学激活荧光素酶基因表达法(chemical-activated luciferase gene expression, CALUX)[55]，该方法同EROD方法相类似，其原理是构建含有二噁英应答元件(DRE)的虫荧光素酶报告基因质粒，将该质粒转染入肝癌细胞后,二噁英类不仅能通过AhR信号通路引起CYP1A1酶的表达，还能表达质粒中的虫荧光素酶报告基因。通过裂解细胞并加入荧光底物后便可检测荧光强度，且荧光强度同虫荧光素酶浓度成正比。同EROD方法相比，因为CALUX法直接对表达的虫荧光素酶进行检测，该方法检测灵敏度更高(0.033 pm左右)[56-57]，检测时间更短，更适合于大量样品的筛选和半定量测定。基于不同的离体细胞类型和质粒，已存在多种CALUX检测系统[56-58]。CALFUX与CALUX不同的是以增强的绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因，该检测方法不需要裂解细胞和荧光底物，能够直接在活细胞中测得表达的EGFP的荧光强度，是一种更为方便的检测方法[59]，但是EGFP的降解半衰期为24h[60]，远高于虫荧光素酶的3h，因此在CALFUX的应用中，净化后样品残留的PAHs能够引起EGFP的表达并在短时间内不被降解，这可能直接影响CALFUX法短期暴露检测结果[61]。

重组基因酵母检测法:重组基因酵母法是在酵母中构建AhR表达系统，通过GAL1/10双向启动子同时表达人或小鼠的AhR和ARNT，并转入含有二噁英应答原件( DRE)的β-半乳糖甘酶报告基因质粒[62-63]。相比于离体细胞的生物检测方法，重组基因酵母检测法有具有一些优势。酵母不但易于培养，检测成本低廉，并且酵母作为真核生物，相比原核生物，具有更为复杂的表达调控机制，例如酵母菌能够进行简单的蛋白质翻译后修饰[64]。与哺乳动物细胞相比，最大的不同在于酵母本身并不内源表达AhR，并缺少一些复杂的代谢功能，因此对于酵母检测系统来说，本身的背景是十分“干净”的[65]。相较于哺乳动物细胞检测系统，酵母检测系统对于二噁英类检测限较高，这主要有两方面原因造成，一方面，酵母的细胞壁会对二噁英类等疏水性物质有部分阻碍，但相关研究也表明酵母细胞壁存在对疏水性物质的转运通道；另一方面，酵母培养基同细胞培养基相比，缺乏血清所提供蛋白和脂质成分，而二噁英类等亲脂性物质主要通过血清中的低密度脂蛋白进行转运[63]。

4.2 DNA结合分析

由于细胞内生成AhR:ARNT异源二聚体同DNA结合数量与2,3,7,8-TCDD暴露浓度定量关系，这种定量关系是DNA结合分析检测样品中二噁英类浓度的基础。可以通过凝胶阻滞实验[66]和PCR方法[67]来定量测定AhR:ARNT异源二聚体同DNA结合情况。凝胶阻滞实验并不利于对二噁英类样品的高通量检测，而一些PCR方法具有高通量特性。例如AhRC PCRTM[67]，二噁英类化合物激活试剂盒中的AhR使其与含有二噁英相应元件的的DNA探针结合，而结合的AhR受体能被微量反应管表面捕获，在反应管中洗去未于受体结合的DNA探针，对结合AhR受体的探针在PCR中进行扩增从而定量检测出被激活的AhR的数量。一些基于DNA结合分析方法的二噁英类生物检测利用新的技术不断提高对二噁英的检测灵敏度，例如纳米金技术[68]，此方法通过引入纳米金颗粒标记的含DRE核心序列的双链核酸探针，同由二噁英类结合并活化的AhR结合，再与ARNT二聚化后结合DRE，形成AhR配体-AhR-ARNT-DRE复合物，在ARNT单克隆抗体的特异性捕获下,该复合物被固定于固相载体上,最后利用Scanometric检测方法得到二噁英类检出浓度，由于纳米金信号易于放大，该方法的检测限是传统生物法的100倍以下。

4.3 酶连免疫方法

二噁英的酶免疫分析是以抗体对抗原的特异性吸附为基础的。酶免疫分析(EIA)法一般以二噁英(PCDD/Fs)为抗原，生产酶标记的鼠抗或兔抗，样品中的二噁英可与酶标记的鼠抗或兔抗发生免疫反应，通过酶催化底物发光或显色而定量[69]。二噁英类的酶免疫分析法进过不断发展已越来越成熟。当前得到广泛应用的高通量二噁英类酶免疫法主要有竞争性酶免疫分析法ELISA[70]，该方法是根据鼠单克隆抗体DD3与二噁英类特异性结合的特点而建立的竞争抑制酶免疫方法。使用酶竞争配合物辣根过氧化物酶(HRP)和样品中二噁英类共同竞争有限的DD3抗体的特异性结合位点。并以一系列不同浓度的 2,3,7,8-TCDD为标准物质做出的剂量-效应曲线，计算出环境样品中二噁英类的TEQ，该检测方法中，螯合物的荧光强度与二噁英类的TEQ成反比。

5 二噁英类生物检测法的应用

5.1 环境样品中二噁英类快速筛查

样品经过高效的前处理过程后，通过高通量二噁英类生物检测可以得到与化学检测方法相接近的分析结果。同化学检测方法相类似，样品前处理是二噁英类生物检测的关键[71]，前处理的主要目的是去除影响生物检测的干扰物质，包括了脂质和多环芳烃类等。现阶段，针对样品中二噁英类生物快速筛查，多种商品化的生物检测技术都整合了完整的样品前处理方法，并能够分离PCBs和PCDD/Fs组分。虽然生物检测方法已被广泛的应用[72-73]，然而由于环境基质的复杂性，针对环境样品的二恶英类生物筛查的结果往往并不理想。

为了验证二噁英类生物检测法和化学分析法结果的相关性，David等[74]采用XDS-CALUX法和高分辨色质谱法得到的结果同时进行比较，该研究先以EPA SITE研究提供的209 SITE土壤和沉积物样品为检测样品，发现整体样本中CALUX-TEQ是GC/MS-TEQ的9.4倍，利用广义估计方程(GEE)建立了CALUX-TEQ与GC/MS-TEQ数学模型，模型R2=0.892，斜率接近1而截距不为零，表明两个检测结果间有强相关性，得到的模型再对36个土壤和8个飞灰独立样品的CALUX-TEQ对应的GC/MS-TEQ进行预测。模型对于二噁英类中浓度的土壤样品(1～3000 pg·g-1)预测具有较好的结果，这个范围内模型整体预测TEQ值是GC/MS-TEQ的1.22倍，生物检测与化学分析结果相接近。

很多研究都表明，针对于环境样品，生物检测法得到总毒性当量要远大于化学分析方法的结果[75-76]，而针对于GC/MS-TEQ小于CALUX-TEQ原因，David等也在数据上进行了探究，首先按WHO推荐的17种二噁英类同系物的TEF计算得到样品总的毒性当量WHO-TEQ，而后采用CALUX法得到二噁英类同系物的REP来计算校正的总毒性当量Adjusted-TEQ。计算得到42个土壤和沉积物样品整体的Adjusted-TEQ是WHO-TEQ整体的1.5倍作用，这一结果表明，CALUX-TEQ大于GC/MS-TEQ的部分原因是由于WHO的TEF和CALUX法得到的REP不对应所造成的。为了更完整的探究生物检测和化学分析结果的不匹配性，Amy[77]等利用GC-HRMS和GC×GC-TOFMS验证了样品前处理方法对生物检测结果的影响。GC-HRMS被用来验证目标化合物二噁英类是否能够完全进入最终的检测组分，而结合TOFMS的二维色谱用来验证其他进入检测组分的干扰物。GC-HRMS检测的结果表明，简化的样品前处理方法能够使绝大多数的目标化合物进入检测组分，而GC×GC-TOFMS的结果表明前处理方法不能完全去除生物检测干扰物质，例如PAHs和脂肪族化合物，而其他的一些研究表明这些干扰物还包括了PBDD/Fs，PBDE等[49]。尽管生物检测方法对二噁英类具有极高的灵敏度，但是前处理过程未完全去除的干扰物质可能降低了生物检测的可靠性。

针对环境样品二噁英类检测的生物检测技术更应当定位成一种生物筛查手段，主要目的是在降低检测成本和减少检测时间条件下对数量庞大的环境样品获得相对准确的检测结果。这些结果包括以阀值的概念来判断二噁英类污染和以生物毒性大小的来辨别二噁英类污染的严重程度。

5.2 以AhR效应为终点毒性检测

环境污染物中，能够激活AhR信号通路的激动剂不仅仅包括了二噁英类，还包括了PAHs、PBDDs、PBDEs等几大类已知或未知的化合物，尽管这些化合物最终的生物学和毒性效应不尽相同，但其部分在体内代谢活化的激活是通过AhR介导的，能够不同程度上激活AhR信号通路。因此对针对这些物质的环境污染物筛查和风险评价，AhR效应仍然是一个很重要的检测终点，通过适当的改变样品前处理方法、分离和检测条件，便可以方便地对不同类型AhR激动剂进行检测，表征这些化合物或检测组分中所具有的AhR效应大小。

伴随着工业化的发展，大量人工合成有机化合物和伴随的工业副产物被不断的排入环境中，这些化合物的潜在毒性对整个生态系统构成了巨大风险。具Richard Judson等统计[78]，至少约2/3的化合物具有一定的危害信息，而仅有1/4的化合物具有详细的毒理学数据。以化合物毒性数据建立起的环境基准对于监管这些化合物的使用和排放具有重要意义。然而这些化合物在环境中含量低，且单体分离困难，很难获得高剂量的样品直接进行活体实验。作为一种高通量的离体生物毒性筛查手段，二噁英类生物检测法能够在较低剂量下快速灵敏的筛选出具有AhR效应的环境污染物。表1总结各类二噁英类生物检测方法对潜在AhR效应化合物的筛查结果。表中不同的AhR效应化合物的毒性被以相对毒性效应(REP)或半最大效应浓度(EC50)表示，部分数据已被用来评价该类化合物的在环境中整体的污染状况。

表1 高通量生物检测方法对潜在芳香烃受体效应化合物的筛查

二噁英类生物检测方法同样能够对污染环境整体的AhR激动剂水平进行评价，从而筛选和甄别这一大类污染物的高风险区[83-87]。如果能够与同步开展的化学分析结合，就有可能甄别主要贡献因子。这种因果关系分析工具(causative analysis)包括生物效应引导的污染物识别技术[88]，即Effect-Directed Analysis或Effect-directed Identification(EDA/EDI)，是常用来实现环境污染筛选和鉴定的方法。EDA始终以污染物的生物效应为导向，采用多级不同色谱选择性的色谱对储存液或上级色谱分离液生物筛选结果为阳性的组分进行分离和生物筛选，这样通过不同特性的色谱分离将复杂的混合化学物分离出主要效应馏分，再对效应化合物进行定性和定量分析。这种以污染物AhR效应为导向的EDA技术已经应用于原油污染[89]、污水污染[90]、工业污染[91]等的环境调查中。W.Brack和K. Schirmer[91]采用EROD法，针对德国工业区沉积物污染样品进行EDA分析，发现氧和硫杂环化合物是主要的芳香烃受体效应化合物。在EDA技术中，二噁英类生物检测方法极大的缩短了生物效应的检测难度，提高了检测效率和灵敏度，同时以污染物的AhR效应为检测终点的二噁英类生物检测方法能够方便的加入到多靶点的生物检测流程中，同步检测包括遗传毒性、内分泌干扰效应和神经毒性等[92-94]，对污染物进行更加客观和全面的评价。

6 展 望

AhR信号通路的复杂性使我们很难描绘完整而详细的分子作用机制，原因在于针对几个关键性问题我们仍然缺乏足够的了解，例如AhR LBD是如何调控数量众多且结构各异的内源或外源化合物以及AhR所参与的内源调控及其所产生的生物学效应。这需要我们进一步了解AhR结构信息来对AhR及其配体的作用行为进行预测，也需要进一步利用基因组学、代谢组学和蛋白组学等高通量数据来挖掘更为精细的AhR作用模式[95-96]，从而更完整的对二噁英类的毒性进行评价。

虽然基于各种原理开发的二噁英类生物检测方法以得到了广泛的应用,但针对环境样品的二噁英类快速筛查，样品前处理过程仍然占据着整个检测过程的大部分时间。对复杂样品中不同类型AhR激动剂进行分离是实现生物测试与化学分析结果可比的关键。尽管目前的商品化净化柱缩短了一部分前处理时间，但是其仍然制约着生物检测法高通量的发展方向。因此需要进一步展开对生物检测方法的前处理流程研究，建立简单、快速、经济和相对准确的生物测试流程。同时，二噁英类生物检测方法流程中的质量控制是提高检测果可信度的重要途径，但是目前还没有成熟的生物检测质量控制方法和标准，是二噁英生物检测方法被环境部门采纳应用中需要解决的关键问题。

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Review on the Toxic Mechanisms and Bioassay Approaches for Dioxin-like Compounds

Huang Chao1, Chen Ning1,2, Yang Mingjia1,*, Feng Zhongfu3, Ma Mei1, Wang Zijian1

1. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Beijing 100085 2. Anhui Academy of Environmental Science, Hefei 230071 3. Bonna-Agela Technologies Inc, Tianjin 300462

Received 1 July 2014 accepted 27 July 2014

The toxic dioxin-like compounds are typical representatives of persistent organic pollutants (POPs). They have a variety of sources and are attracted widespread attention. In past years, some congeners of dioxins and furans were thought metabolically stable in biota, and their toxic effects were mainly mediated through aryl hydrocarbon receptor (AhR). Recent research demonstrated that the toxic mechanisms of these AhR agonistic compounds should be more complicate then previously recognized. Based on recent research progress, this review article presents some new insights into the toxic modes of action (MoA) and metabolic pathways. Also, high-throughput bioassay approaches developed based on MoA were summarized for the sake of screening and risk assessment of dioxin-like compounds in environmental media.

Dioxin-like compounds; AhR; mechanism of toxicity; metabolism; bioassay

环保公益性行业科研专项(No. 201209016)；国家自然科学基金青年基金(No. 21107131)；国家高技术研究发展计划项目(No. 2011AA060603)；国家高技术研究发展计划项目(No. 2014AA06A506)

黄超(1989-)，男，硕士，主要研究方向为水生态毒理学, Email: hch-app@163.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: avanotice@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20140701001

2014-07-01 录用日期：2014-07-27

1673-5897(2015)3-050-13

X171.5

A

杨明嘉(1981—)，女，博士，助理研究员，主要研究方向为水生态毒理学。

黄超，陈凝，杨明嘉, 等. 辽东半岛海域鱼贝中有机氯农药残留及其风险评估[J]. 生态毒理学报，2015, 10(3): 50-62

Huang C, Chen N, Yang M J, et al. Review on the toxic mechanisms and bioassay approaches for dioxin-like compounds [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 50-62 (in Chinese)