外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗L-精氨酸代谢的影响

王建，窦巧惠，于世欣，王逸筠，崔秀敏

土肥资源高效利用国家工程实验室，山东农业大学资源与环境学院，泰安 271018



外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗L-精氨酸代谢的影响

王建，窦巧惠，于世欣，王逸筠，崔秀敏*

土肥资源高效利用国家工程实验室，山东农业大学资源与环境学院，泰安 271018

一氧化氮(nitric oxide，NO)作为生物活性分子，广泛参与各种生物和非生物胁迫。采用营养液培养，研究Cu胁迫下番茄体内L-精氨酸、NO、多胺代谢对外源NO的响应机制，以期为铜污染区域蔬菜种植提供科学依据和技术支持。结果表明，Cu胁迫下添加外源SNP(硝普钠，外源NO供体)能够调节番茄根系和叶片中精氨酸脱羧酶(Arginine Decarboxylase ，ADC)、鸟氨酸脱羧酶(Ornithine Decarboxylase，ODC)及一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)活性。根系中，外源SNP能够上调NOS活性， L-精氨酸代谢向着NO合成方向进行；叶片中，外源SNP能够同时上调ADC、ODC、NOS活性，PA、NO的合成同时进行；此外，Cu胁迫下添加外源SNP能够增加根系和叶片L-精氨酸含量，而作为PA、NO的合成前体，精氨酸含量升高无疑会间接促进PA、NO的合成，从而提高番茄对Cu胁迫的抵抗能力。

Cu胁迫；番茄；一氧化氮；L-精氨酸；多胺

在过去的50年中，大约有939 000 t的Cu排放到全球环境中，其中大部分进入土壤，引起了土壤重金属污染[1]。重金属污染不仅引起土壤组成、结构和功能的变化，还能够抑制作物根系生长和光合作用，导致一系列生物代谢过程紊乱，致使作物减产甚至绝收[2]。更为重要的是，重金属还可通过食物链迁移到动物、人体内，危害人体、动物健康[3-4]。

NO是一个不稳定的自由基，作为细胞间信使在植物体内各种生理过程中起着关键作用，如根系伸展[5]、防御体系相关基因的表达和细胞程序性死亡[6]。除此之外，NO还参与植物对生物和非生物胁迫的响应，如盐害[7]、干旱[8]、重金属胁迫[9-11]等。植物体内NO的来源主要有酶促[NOS、硝酸还原酶(Nitrate Reductase，NR)]和非酶促途径。在酸性环境中，亚硝酸还原也会形成NO[12]。

L-精氨酸是植物体内碳氮比较高的氨基酸之一，植物体内L-精氨酸通过ADC、ODC合成酶合成多胺[13-14]，多胺(腐胺、精胺、亚精胺)是生物体内的具有生理活性的一类低分子量的直链脂肪族含氮碱，它们参与细胞分裂、DNA的凝聚、膜的稳定、激素的信号转导以及动植物的抗逆性等多种生理生化过程和反应[15]。除了用于合成多胺外，植物体内的L-精氨酸还可以通过NOS合成酶合成NO[16]，用于缓解植物对生物和非生物胁迫的伤害。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 供试材料

供试番茄(Solanum lycopersicum L.)为“改良毛粉802F1”。NO供体硝普钠([Na2Fe(CN)5]NO，SNP，购自Sigma公司)和Cu2+供体CuCl2的适宜浓度由预备试验确定，先用蒸馏水配成200 μmol·L-1的母液，4 ℃避光保存，用时按所需浓度稀释。牛血红蛋白(Hb，购自Sigma公司)为NO的清除剂。

1.2 试验设计

试验在山东农业大学智能温室内进行，用Hoagland营养液培养幼苗。种子经55 ℃温汤浸种消毒15 min，然后在润湿的吸水纸上26 ℃催芽。待种子露白后，播于洗净的蛭石中，萌发后用1/4 Hoagland营养液浇灌。当幼苗具有3～4片真叶片时，挑选生长一致的植株洗净根部蛭石后，移栽于4 L塑料桶中，用厚度为3 cm的泡沫塑料板做成长方形盖子，覆盖在塑料桶顶部。每盆栽4株，用1/2 Hoagland营养液进行栽培。1周后换成完全营养液，此后每3 d更换一次营养液。营养液栽培期间用电动气泵24 h连续通气。

番茄植株长至5～6片真叶片时进行Cu胁迫处理。实验设5个处理：(1)对照，Hoagland完全营养液；(2)50 μmol·L-1CuCl2;(3)50 μmol·L-1CuCl2+100 μmol·L-1SNP；(4)50 μmol·L-1CuCl2+100 μmol·L-1SNP+0.1% Hb；(5)50 μmol·L-1CuCl2+0.1% Hb，分别用CK、Cu、Cu+S、Cu+S+H、Cu+H表示。每个处理三次重复，温室内随机排列。用低浓度的KOH或者HCl调节pH至5.5±0.2，温室内光照(光照强度为320 μmol·m-2·s-1)约12 h，白天最高温度32 ℃，夜间最低温度15 ℃。于处理后的1, 3, 6, 24, 48, 72 h分别收获植株根系及叶片。部分新鲜样品用于测定酶活性，其它样品液氮速冻，-80 ℃贮存备用。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 L-精氨酸含量测定

称样品30～50 mg于水解管中，加6 mol·L-1盐酸6 mL，在酒精喷灯上封口，然后置于110 ℃烘箱中水解10 h。将已水解的溶液转入25 mL容量瓶中，再用水冲洗水解管定容，摇匀过滤。滤液用于L-鸟氨酸、精氨酸测定。吸滤液1～2 mL注入刻度试管中，加10%氢氧化钠1～2 mL，用少量水冲洗管壁，摇匀后再加0.15%甲萘酚0.3 mL和次氯酸钠1 mL，然后再加水至9 mL，摇匀，立即置于(连同试管架) 冰水浴中(冰块加一定量水)。显色20 min，取出加40%尿素1 mL摇匀，室温下放5～10 min在721 型分光光度计上530 nm 波长下比色，读其光密度，求精氨酸含量。

精氨酸含量=斜率×样品稀释倍数×光密度×10-6

1.3.2 ADC、ODC活性测定

①参照赵福庚等[17]具体方法如下：

取1.0 g 幼苗叶片和根系，加入3 mL 预冷的提取液[50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液，pH为6.3，内含5 mmol·L-1EDTA、0.1 μmol·L-1PMsF(苯甲基磺酰氟)、40 μmol·L-1磷酸吡哆醛、不溶性PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、5 mmol·L-1DTT(二硫苏糖醇)、20 mmol·L-1Vc)]，研磨后4 ℃下12 000×g 离心15 min，取上清液加硫酸铵达饱和度60%，离心后沉淀溶于10 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 6.3) ， 4 ℃透析过夜，再加入2 倍体积的预冷丙酮，沉淀溶于磷酸缓冲液中( pH 6.3)， 4 ℃透析过夜后15 000×g 离心15 min，上清液用于酶活性测定

②ADC、ODC活性测定

反应系统体积1.5 mL，包括1 mL100 nmol·L-1Tris-Hcl缓冲液(pH 7.5，内含5 mmol·L-1EDTA、40 μmol·L-1磷酸毗哆醛和5 mmol·L-1DTT)、0.3 mL(1.4 mg蛋白·mL-1)ADC提取液，于37 ℃水浴中放置2 min后，加入0.2 mL 25 mmol·L-1q L-Arg、L-Orn(调pH至7.5)。37 ℃下反应60 min后，加入PCA(高氯酸)至终浓度5%(对照在开始即加入PCA)，以3 000 g离心l0 min，取0.5 mL上清液加人l mL 2 mol·L-1NaOH，混合后加入10 μL苯甲酰氯，涡悬振荡20 s。25 ℃下反应60 min后，加入2 mL饱和NaCl，混合后加入2 mL乙醚。振荡，1 500×g离心5 min，收集l mL醚相，于50 ℃下蒸发至干，再溶于3 mL重蒸甲醇中，以紫外分光光度计于波长254 nm处测定OD值。酶活以nmol(put)·mg-1(蛋白) ·h-1表示。

1.3.3 多胺含量测定

采用液相色谱法参照刘友良等[18]具体方法如下：

①仪器和试剂

Waters 1500系列，2487双波长紫外/ 可见检测器，Breeze色谱工作软件。腐胺、亚精胺为Fluka产品，精胺为Sigma产品，甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为国产分析纯。

色谱柱：Novapak C18柱(Waters，150×3.9 mm, 4 μm)。流动相：甲醇：水( 60：40，V/ V )，检测波长为230 nm，流速0. 7 mL·min-1，柱温30 ℃。取植物材料1.0～ 2.0 g，加入4mL预冷的5%高氯酸(V/V)冰盒中研磨、浸提1 h后离心( 15 000×g，30 min，4 ℃)。取500 μL上清液加10 mL带盖塑料离心管中，加入7 μL苯甲酰氯，再加入1 mL 2 mol·L-1NaOH，涡漩20 s后在37 ℃水浴反应20 min。加入2 mL饱和NaCl溶液，混匀后用2 mL乙醚萃取，1 500×g离心5 min后，取1 mL醚相真空干燥，用100 μL甲醇涡旋溶解后过0. 45 μm的滤膜，取10 μL进样。将 3 种多胺( Put、Spd和Spm) 的标准品配成1 mmol·L-1的贮液，各取40 μL 按上述方法进行苯甲酰化。分别取苯甲酰化后的多胺标准液0.03、0.06、0.12、0.25、0.50、0.75、1.0 nmol·(10 μL)-1进样，以面积对进样量作曲线，计算曲线方程和相关性系数。

②多胺含量的计算，采用面积外标法：

实际含量=(A样品/A标样)×(V/样品质量)×C标×3

式中：A为峰面积；C标为标样浓度；V为定容体积；3为标样稀释倍数。

1.3.4 NOS活性测定

取1 g处理后番茄根系和叶片，制备成10%的组织匀浆，2 500 r·min-1离心10 min，然后参照NOS活性采用试剂盒(南京建成)测定。

1.3.5 内源NO含量的测定

内源NO含量测定：取0.5 g切成1cm长的叶片鲜样，在含100 U CAT和100 U SOD的溶液中浸泡5 min用以除去植物内源活性氧，然后加入5mL纯化好的氧合血红蛋白溶液(5 mmol·L-1)反应2 min，测定反应液在577和591 nm吸光值。

内源NO释放量=(OD577-OD591)/11.2

1.3.6 番茄生物量测定

处理8 d后，用去离子水冲洗干净，吸干多余水分，测定番茄地上部及地下部鲜重(FW)。

1.4 数据处理

采用DPS统计软件对平均数进行方差分析，Duncan法多重比较(P<0.05，不同字母表示差异显著)，Microsoft Excel软件绘图。

2 结论(Results)

2.1 外源NO对Cu胁迫下番茄叶片和根系L-精氨酸含量的影响

如图(1A)所示，单独Cu胁迫下番茄叶片处理期间L-精氨酸含量呈降-升-降变化，处理24 h L-精氨酸含量达到最大值，处理72 h时L-精氨酸含量降至最低。Cu胁迫下添加SNP后L-精氨酸含量呈“∧”趋势，处理后6 h L-精氨酸含量出现峰值此后开始下降，处理结束时降至最低。除添加SNP后1 h、24 h外，其余时间段L-精氨酸含量均高于Cu处理。Cu+S处理下添加外源0.1% Hb，L-精氨酸含量在处理期间呈“升-降-升”趋势，恰与Cu+S处理趋势相互补，说明0.1% Hb可以消除SNP释放的NO对L-精氨酸的促进作用；处理期间除处理后1 h、24 h外，其余时间段L-精氨酸含量均低于Cu+S处理。Cu胁迫下单独添加外源0.1% Hb，整个处理期间L-精氨酸含量变化呈“N”趋势，除处理后1 h、24 h、48 h时外其余时间段L-精氨酸含量均高于Cu胁迫。

图1 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗叶片(A)和根系(B)中L-精氨酸含量的影响注：条形图上不同字母表示差异显著(P<0.05)Fig. 1 Effect of exogenous NO on L-Arginine contents in roots (A) and leaves (B)of tomato under copper stressNote: Different letters above the bars mean significant at the 0.5 level, the same below

Cu胁迫下，根系L-精氨酸含量在处理期间呈下降趋势图(1B)，在处理后1-3 h、6-24 h虽有所波动，但增加幅度不显著，处理结束时L-精氨酸含量降至最低，整个Cu胁迫期间根系中L-精氨酸含量均低于CK。Cu胁迫下添加外源SNP后1-6 h根系中L-精氨酸含量急剧降低，处理后6 h降至最低；6 h后至处理结束呈上升趋势但上升幅度较小，除处理后3 h、6 h外，其余时间段L-精氨酸含量均高于Cu处理。Cu+S处理下添加外源0.1%Hb 3 h后L-精氨酸含量急剧下降，处理6 h时L-精氨酸含量降至最低，处理后6-48 h期间有小幅度回升，但48 h后至处理结束时又开始下降；除处理后3 h、6 h、72 h外其余时间段L-精氨酸含量均高于Cu+S处理。Cu胁迫下单独添加外源0.1% Hb后，根系中L-精氨酸含量呈“升-降-升”变化趋势，除处理后3 h、6 h时外，其余时间段L-精氨酸含量均高于Cu处理。

2.2 外源NO对Cu胁迫下番茄叶片和根系ADC活性的影响

如图(2A)所示，叶片中，处理间ADC活性差异显著。Cu处理从胁迫开始至处理24 h番茄ADC活性呈下降趋势且均低于CK，处理后24 h ADC活性降至最低，24 h后至处理结束ADC活性呈缓慢回升的趋势；Cu胁迫下添加外源SNP后1 h至3 h ADC活性呈上升趋势，处理3 h时其活性达到最大值，ADC活性远远高于Cu处理；处理后3 h至48 hADC活性呈逐渐下降趋势，48 h时ADC活性降至最低，除48 h外其余时间段ADC活性均高于Cu处理；添加外源SNP 48 h后至处理结束ADC活性呈上升趋势，处理后72 h ADC活性高于对照。Cu+S处理下添加外源0.1% Hb降低ADC活性，整个处理期间ADC活性呈“N”型变化趋势，处理后48h时ADC活性降至最低，Cu胁迫处理下添加外源SNP能够增加ADC活性。Cu胁迫条件下添加外源0.1% Hb，整个处理期间ADC活性变化呈“锯齿”状趋势，处理48 h其活性降至最低。

如图(2B)所示：根系中，同CK相比，Cu胁迫处理开始至6 h时 ADC活性呈“∧”趋势，且各时间段ADC活性均低于CK，处理后24 h ADC活性出现峰值，此后至处理结束ADC活性急剧下降，48 h ADC活性降至最低此后略微回升。整个处理期间CK与Cu胁迫间差异显著。Cu胁迫条件下添加外源SNP，ADC活性变化趋势与Cu胁迫下变化趋势相似，整个处理期间除处理后1 h时ADC活性高于Cu处理外，其余时间段ADC活性均低于对照，处理间除48 h外其它时间段差异均显著。Cu+S处理下添加外源0.1% Hb，整个处理期间ADC活性呈“N”型变化趋势，处理后24 h其活性达到峰值，处理期间ADC活性均高于Cu+S，处理间差异显著，同Cu处理和Cu+S+H处理相比，添加外源SNP抑制ADC活性。Cu胁迫条件下添加外源0.1% Hb，ADC活性呈“W”型趋势，除处理后24 h、72 h外，其余时间段ADC活性均高于Cu处理。

图2 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗叶片(A)和根系(B)ADC活性的影响Fig. 2 Effect of exogenous NO on ADC activity in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

2.3 外源NO对Cu胁迫下番茄叶片和根系ODC活性的影响

如图(3A)所示：叶片中Cu胁迫处理后番茄ODC活性呈先上升后下降的趋势，处理后6 h ODC活性达到最大值，处理结束时降至最小值；除处理后1 h、24 h外，其余时间段ODC活性均低于对照。Cu胁迫条件下添加外源SNP，ODC活性呈“W”型变化趋势，处理后6 h ODC活性出现峰值，处理后48 h降至最小值；处理后1 h、6 h、72 h ODC活性高于Cu胁迫，其余时间段低于Cu处理。Cu+S处理下添加外源0.1% Hb后，ODC活性变化趋势与Cu+S处理相似，Cu+S+H处理后1 h ODC活性出现峰值；除处理后1 h、48 h外ODC活性均低于Cu+S。Cu胁迫条件下添加外源0.1% Hb，ODC呈“M”型变化趋势，处理后48h ODC活性出现最大值；除处理后6 h、24 hODC活性低于Cu胁迫外，其余时间段均高于Cu处理。与CK相比Cu胁迫对ODC活性有抑制作用，与Cu处理和Cu+S+H处理相比，添加外源SNP能够增加ODC活性。

如图(3B)所示：Cu胁迫处理后根系中ODC活性呈“W”型趋势，处理后1 h ODC活性出现峰值，48 h后其活性降至最低；处理后1-6 h ODC活性高于对照，6h后至处理结束ODC活性均低于对照，处理后最初三个时间段Cu胁迫能够显著增加根系中ODC活性，但24 h后至处理结束，Cu胁迫对ODC活性的激活现象消失，ODC活性低于CK。Cu胁迫条件下添加外源SNP，ODC活性呈先下降再上升48 h后趋于稳定，除处理后3 h、48 h外，其余时间段ODC活性均低于Cu处理，根系中。Cu+S处理下添加外源0.1% Hb后1-24 h ODC活性呈先下降后上升趋势，处理后24 h至处理结束ODC活性趋于稳定。除处理后3 h、6 h时外，其余时间段均高于Cu+S处理，Cu处理和Cu+S+H处理相比，Cu胁迫条件下添加外源SNP抑制根系中ODC活性。Cu胁迫条件下添加0.1% Hb，处理后24 h时ODC活性出现峰值，处理72 h时ODC活性降至最小值，除48 h外其余时间段ODC活性均高于Cu胁迫。

2.4 外源NO对Cu胁迫下番茄叶片和根系腐胺含量的影响

由图(4A)可以看出，随着处理时间的延长，Cu胁迫条件下叶片中腐胺含量呈先升后降的趋势，处理后48 h腐胺含量出现峰值；除处理后1 h、3 h、6 h外，其余时间段腐胺含量均高于对照。Cu胁迫下添加外源SNP，叶片中腐胺含量变化与Cu胁迫相似，但添加外源SNP后腐胺含量峰值出现在处理后24 h，除处理后1 h、48 h、72 h外，其余时间点腐胺含量均高于Cu胁迫。Cu+S处理下添加外源0.1% Hb，处理后1～6 h、6 h至处理结束腐胺含量均呈先上升后下降趋势，处理后24 h出现峰值，除处理后1 h外其余时间段腐胺含量均低于Cu+S处理。Cu胁迫下单独添加外源0.1% Hb后，叶片中腐胺含量变化呈“W”型趋势，除处理3 h、24 h、48 h外，其余时间段腐胺含量均高于Cu胁迫。如图所示各处理之间在同一时间点差异均达到显著水平。

图3 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗叶片(A)和根系(B)ODC活性的影响Fig. 3 Effect of exogenous NO on ODC activity in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

图4 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗叶片(A)和根系(B)中腐胺含量的影响Fig. 4 Effect of exogenous NO on putrescine contents in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

图(4B)中，Cu处理下，根系中腐胺含量变化呈“M”型趋势，处理后48 h根系中腐胺含量出现峰值，除处理后24 h外其余时间段腐胺含量均高于对照。Cu胁迫下添加外源SNP，根系中腐胺含量变化呈“N”型趋势，处理结束时腐胺含量出现峰值，整个处理期间根系中腐胺含量均高于Cu胁迫。Cu+S处理下添加外源0.1% Hb，整个处理期间根系中腐胺含量显著低于Cu+S处理，但在处理期间腐胺变化幅度不大。Cu胁迫下单独添加外源0.1% Hb后，番茄根系中腐胺含量呈先上升后下降的趋势，处理后6 h出现峰值，整个处理期间腐胺含量均低于Cu处理。

2.5 外源NO对Cu胁迫下番茄叶片和根系亚精胺含量的影响

如图(5A)所示：Cu、Cu+S处理在整个处理期间叶片中亚精胺变化均呈先上升后下降的趋势，且亚精胺含量均在处理后48 h出现峰值；各处理间在整个处理期间差异显著。Cu处理期间叶片中除72 h外其余时间段亚精胺含量均高于对照。Cu+S处理期间亚精胺含量均高于Cu处理。同Cu+S处理相比，添加外源0.1% Hb后亚精胺含量变化呈现先下降后上升趋势，但下降和上升幅度均不大，整个处理期间亚精胺含量均低于Cu+S处理，且处理期间处理间异显著。Cu+H处理下叶片中亚精胺含量先上升后下降，同Cu处理相比，整个处理期间亚精胺含量均低于Cu处理，各时间段处理间差异显著。

图(5B)根系中，Cu、Cu+S处理在整个处理期间亚精胺变化均呈先上升后下降的趋势。Cu胁迫处理期间根系中亚精胺含量在处理后24 h出现峰值，除72 h外其余时间段均高于对照。Cu+S处理期间根系中亚精胺含量在处理后48h出现峰值，除处理后72 h外其余时间段根系中亚精胺含量均高于Cu处理。Cu+S处理条件下添加外源0.1% Hb，根系中亚精胺含量变化呈“降-升-降”趋势，整个处理期间除72 h外其余时间段亚精胺含量均低于Cu+S处理。同Cu处理相比，添加外源0.1% Hb后根系中亚精胺含量变化趋势与Cu+S处理相似，但整个处理期间亚精胺含量均低于Cu处理。处理期间处理间差异显著。

图5 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗叶片(A)和根系(B)中亚精胺含量的影响Fig. 5 Effect of exogenous NO on Spermidine contents in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

2.6 外源NO对Cu胁迫下番茄叶片和根系精胺含量的影响

如图(6A)所示：Cu、Cu+S处理叶片和根系中精胺含量在处理期间均呈先上升后下降的趋势，且精胺含量均在处理后48 h时出现峰值；外源SNP显著增加Cu胁迫下根系和叶片中精胺含量。同CK相比，Cu处理条件下叶片和根系中精胺含量均高于对照，且处理期间处理间差异显著。同Cu+S处理相比，添加外源0.1% Hb后叶片中精胺含量变化在处理期间呈“M”型趋势，且在整个处理期间精胺含量均显著低于Cu+S处理。同Cu处理相比，添加外源0.1% Hb后整个处理期间叶片中精胺含量变化先上升后下降，处理后6 h精胺含量出现峰值，且处理期间差异显著。

根系中(6B)，同Cu+S处理相比，添加外源0.1% Hb后整个处理期间精胺含量呈先下降后上升趋势，整个处理期间精胺含量均低于Cu+S处理，且在处理后24 h根系中精胺含量降至最，处理期间差异显著。同Cu处理相比，添加外源0.1% Hb处理期间根系中精胺含量显著降低，呈先下降后上升趋势，处理后6 h根系中精胺含量降至最低，Cu处理与Cu+H处理处理间差异显著。

2.7 外源NO对Cu胁迫下下番茄叶片和根系多胺总量的影响

如图(7A、B)所示，Cu、Cu+S处理叶片和根系中多胺总量在处理期间均呈“∧”变化趋势，处理期间多胺总量均高于CK。Cu胁迫条件下添加外源SNP能进一步提高叶片和根系中多胺总量，Cu+S处理下添加外源0.1% Hb，处理期间叶片和根系中多胺总量显著低于Cu+S处理，多胺总量变化呈“M”趋势，数据分析显示外源0.1% Hb能够减弱SNP的效果。Cu胁迫下单独添加外源0.1% Hb，叶片和根系中多胺总量急剧下降，整个处理期间叶片和根系中多胺总量均低于Cu处理。

2.8 外源NO对Cu胁迫下番茄叶片和根系NOS活性的影响

如图(8A)所示，同CK相比，Cu胁迫处理期间叶片中NOS活性呈“ M ”型变化趋势，处理后48 h叶片中NOS活性出现峰值，处理最初NOS活性最低；除处理期后1 h、6 h、72 h外，其余处理NOS活性均高于对照，各处理间差异显著。同Cu处理相比，添加外源SNP处理期间NOS活性呈“降—升—降”趋势，处理后6 h NOS活性达到最大值；处理后1-6 h期间NOS活性均高于Cu处理，6 h后至处理结束NOS活性均低于Cu处理，整个处理期间除24 h、48 h外，其它各处理间差异显著。同Cu+S处理相比，添加外源0.1% Hb后叶片中NOS活性呈“降-升-降”趋势，且在处理后24 h NOS活性出现峰值，除处理后1 h、24 h外其余处理期间NOS活性均低于Cu+S处理，除处理后1 h、48 h外，其余处理期间处理间差异均达到显著水平。同Cu处理相比，添加外源0.1% Hb后叶片中NOS活性呈“ M ”趋势，处理后48 h时NOS活性出现峰值，处理结束时NOS活性最低，除处理后1 h、6 h、48 h外其余处理期间NOS活性均低于Cu处理；除处理后6 h、24 h外，其余处理期间处理间差异均显著。

图6 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗叶片(A)和根系(B)中精胺含量的影响Fig. 6 Effect of exogenous NO on Spermine contents in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

图7 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗叶片(A)和根系(B)中多胺总量的影响Fig. 7 Effect of exogenous NO on PAS contents in roots (A) and leaves (B) of tomato under copper stress

图8 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗叶片(A)和根系(B)中NOS活性的影响Fig. 8 Effect of exogenous NO on NOS activity in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

由图(8B)看出，同CK相比，Cu胁迫处理期间根系中NOS活性呈“∧”趋势，处理最初NOS活性最低，处理后6 h NOS活性出现峰值；除处理后1 h、3 h外，其余处理期间NOS活性均高于CK，除6 h、72 h外且各处理间差异均达到显著水平。同Cu处理相比，添加外源SNP处理期间NOS活性呈“升-降-升”趋势，处理后3 h NOS活性降至最低，处理结束时NOS活性最大；除处理后6 h外其余处理期间NOS活性均高于Cu处理，除处理后3 h、24 h外其余处理期间处理间差异均达到显著水平。同Cu+S处理相比，添加外源0.1% Hb后根系中NOS活性呈“升-降-升-降”趋势，除处理后48 h、72 h外，其余处理期间NOS活性均高于Cu+S处理；整个处理期间处理间差异均达到显著水平。同Cu处理相比，添加外源0.1% Hb根系中NOS活性“N”趋势，除24 h、48 h外，其余处理期间NOS活性均高于Cu处理；除处理后6 h、48 h外处理期间处理间差异均达到显著水平。

2.9 外源NO对Cu胁迫下番茄叶片和根系NO释放量的影响

由图(9A、B)可看出，不同处理条件下，处理后1～6 h期间叶片和根系中NO释放量变化呈相反趋势，处理后6 h至处理结束NO释放量变化趋势相同。处理期间根系中NO释放量普遍高于叶片。这可能是由于在胁迫初期，根系中大量消耗NO，叶片中NO向地下部运输，所以造成处理初期根系中NO含量高于叶片。

叶片中，处理后1～3 h期间叶片中NO释放量急剧下降，处理后3～24 h期间NO释放率逐步大幅上升，处理24h后NO释放率趋于稳定。除处理后3 h、48 h外，其余时间点各处理间差异均不显著。叶片中SNP对NO释放的促进效果不明显。

图9 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗叶片(A)和根系(B)中NO释放量的影响Fig. 9 Effect of exogenous NO on NO release amount in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

根系中，处理后1～3 h各处理叶片NO释放量急剧上升，且在3 h时释放量出现峰值，3～6 h间释放量有所下降，但6 h后至24 h NO释放量开始回升，且24 h后至处理结束NO释放量的变化趋于稳定。但相比与处理后3 h，处理后6 h至处理结束NO释放相对降低。这说明外源SNP在处理初期能够显著增加根系中NO释放量，随着处理时间的延长SNP效果逐渐消失

2.10 外源NO对Cu胁迫下番茄生物量的影响

由表1可知：与CK相比，Cu胁迫下番茄幼苗地上部和根系鲜重显著降低，分别下降66.7%, 62.7%；Cu胁迫下添加外源SNP番茄幼苗地上部和根系鲜重分别比单独Cu胁迫处理增加77.9%和48.0%；Cu+S+H处理的番茄地上部鲜重与Cu+S处理相比显著减少，而根系鲜重无明显差异；Cu+H处理与单独Cu处理相比，番茄地上部鲜重显著下降，根系鲜重变化不明显。

表1 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗生物量的影响

3 讨论(Discussion)

L-精氨酸除作为植物体内重要的氮素贮存物外，还是植物一氧化氮(NO)等信号分子的合成前体，L-精氨酸通过NOS途径合成NO，NO参与植物体内生理生化过程和生物非生物胁迫[19]。本试验中，Cu胁迫处理期间番茄根系和叶片中L-精氨酸含量高于对照，Cu胁迫下添加外源SNP后L-精氨酸含量进一步提升，这与张敏等[20]研究一致。这说明，Cu胁迫下添加外源SNP能够增加叶片和根系中L-精氨酸含量。精氨酸是植物体内PA、NO合成前体，L-精氨酸在ADC、ODC作用下合成PA，或在NOS作用下合成NO。本研究中，铜胁迫条件下，添加外源SNP能够调节L-精氨酸与PA，NO之间的合成关系，在根系中，铜胁迫下添加外源SNP能够促进L-精氨酸向PA合成方向进行，促进根系中PA的合成缓解重金属对根系的伤害。而叶片中，铜胁迫下添加外源SNP后，L-精氨酸能够同时向PA、NO合成进行。

ADC、ODC是植物体内L-精氨酸代谢过程中两个关键酶。L-精氨酸在ADC/ODC的催化作用下合成多胺(图10)，在各种逆境胁迫下如渗透、干旱和重金属盐渍等，植物体内多胺水平均会发生一定变化[21-23]，以调节植物的生长和发育，提高其抗逆能力。研究发现[24]，镉胁迫下能够增加燕麦叶片、根系中腐胺含量，同时ADC活性也升高，但对Spd、Spm含量的影响较低或几乎没有影响。研究认为[25]，Cu、Cd胁迫下水稻叶片中Put含量增加，但Spd含量没有变化，Spm含量却下降；Cu、Cd胁迫下水稻叶片ADC、ODC活性增加，进而促进PA的合成，PA的合成与ADC、ODC活性呈正相关。本试验中，与对照相比，Cu、Cu+S处理的根系和叶片中多胺含量随处理随时间延长呈上升趋势，而多胺含量与ADC、ODC之间却没有严格的正相关关系。ADC、ODC在Cu处理期间叶片中处理处理后6 h两种酶活性较低外，其余时间至少有一种酶的活性较高，根系中除24 h外也出现同时类似现象。而Cu胁迫下添加外源SNP后，除叶片中6 h ADC、ODC活性较低外，根系和叶片中在处理期间至少有一种酶活性较高，也就是说，外源SNP可能对ADC、ODC酶活性没有直接影响，而是通过调节两者之间的代谢关系进而促进多胺合成，而多胺又可以通过木质部和韧皮部转运[26]，这就解释了处理期间多胺合成过程中关键酶活虽然未同时升高，但根系和叶片中多胺含量却呈上升趋势的原因。Cu+S处理下添加外源0.1% Hb后，叶片中ADC、ODC均下降，而根系中这两种酶活性较高。

图10 植物体内L-精氨酸代谢及协调多胺和NO的生物合成[16]Fig. 10 Ariginine metabolism and the coordinate biosynthesis of both polyamines and nitric oxide in plants[16]

NO可以通过一氧化氮合成酶(NOS)反应生成。 研究发现[27]Cd胁迫下，水稻根系中NOS降低，NO释放减少；Cd胁迫下添加外源SNP后提高NOS活性，NO释放增加；Cd+SNP+CPTIO处理条件下NO释放增加，NO释放量与NOS活性呈正相关。本研究发现，同CK相比，Cu胁迫下，处理后6 h根系中NOS活性升高，而内源NO释放在不同处理时间段与NOS活性相关关系不同；Cu+S处理下，NOS活性与NO释放呈现正相关(R=0.42283)；Cu+S+H处理下根系和叶片中NOS活性与NO释放在不同处理期间相关关系不同，这与[23]研究不一致，可能是由于处理方式不同造成的。叶片中，Cu+S处理下除处理后3 h、6 h外NOS活性与NO活性呈现负相关外，其余时间段均呈正相关。因此，Cu胁迫下添加外源SNP后能够上调NOS的活性，从而提高叶片中NO释放量，提高番茄植株对Cu胁迫的缓解能力。根系和叶片多胺和NO合成过程中关键酶活性变化趋势不同，可能由于番茄植株受到根系介质中过多Cu胁迫时，与Cu直接接触的根系首先会对胁迫做出防御性代谢反应[28]。

PAs是一类具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱，高等植物中常见的PAS有腐胺(putrescine，Put)、亚精胺(spermidine，Spd)、精胺(spermine，Spm)。多胺分子质子化的氨基和亚氨基使其成为多聚阳离子，通过离子键和氢键形式与RNA、DNA、蛋白质及带负电荷基团的磷脂等生物大分子相结合，促进生长，提高种子活力和发芽力；刺激不定根产生，促进根系对无机离子的吸收；延缓叶片衰老，延缓叶绿素的分解；提高抗逆性和抗渗透胁迫[27]。本研究中发现，外源SNP能够同时增加番茄根系和叶片中腐胺、亚精胺、精胺的含量。亚精胺、精胺一方面能够抑制磷脂双分子层的反向运动，另一方面稳定细胞膜化合物[30,31]，除此之外，与亚精胺相比精胺含有四个氨基组能够更有效的清除重金属胁迫下产生的超氧化物，进而缓解重金属对番茄的毒害。而有研究认为[32]，植物体内若是积累过量的腐胺会产生硝化胁迫造成细胞死亡，但本研究中发现，铜胁迫下能够积累腐胺，且随着处理时间的延长腐胺的积累量越高，而植株并未表现出毒害现象，这可能是由于处理时间不同造成的。同时本研究发现，铜胁迫条件下添加外源SNP能够显著增加番茄地上部和地下部生物量，增加番茄对铜毒害的抵抗能力。

Cu胁迫下，NO介导了番茄L-精氨酸代谢途径，并能够通过调节根系和叶片中ADC, ODC, NOS活性，调控NO和PA的代谢方向。外源SNP通过上调ADC, ODC活性，促进Cu胁迫下番茄根系L-精氨酸向PA合成方向进行；在叶片中外源SNP则通过上调ADC, ODC及NOS活性促进 PA和NO合成，从而缓解Cu对番茄生长的抑制。

致谢：感谢山东农业大学化学学院裘老师帮助和支持。

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◆

The Effect of Exogenous NO on L-arginine Metabolism in Tomato Seedlings under Copper Stress

Wang Jian1，Yu Shixin，Dou Qiaohui, Wang Yijun, Cui Xiumin*

National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, College of Resources and Environment, Shandong Agricultural University, Taian 271018 China

Received 25 April 2014 accepted 17 August 2014

Nitric oxide (NO), as a bioactive molecule, widely involved in both biotic and abiotic stresses. Using solution culture, this paper reported responding mechanism of L-arginine, NO and Polyamine (PA) metabolism to exogenous NO in tomato seedlings under copper stress. This would hopefully provide scientific basis and technical support for the copper polluted land. These results suggested that adding exogenous SNP(Sodium Nitroprusside, Exogenous NO donor)could modulate the Arginine Decarboxylase (ADC), Ornithine Decarboxylase (ODC) and Nitric Oxide Synthase (NOS) activity in tomato root and leaf under copper stress. In the root, exogenous SNP could increase the NOS activity, which induced L-arginine metabolism toward the direction of NO synthesis. In the leaf, exogenous SNP also enhanced the activity of ADC, ODC and NOS, meanwhile the synthesis of PA and NO was promoted. In addition, adding exogenous SNP could increase L-arginine content in tomato. As an synthetic precursor of PA and NO, arginine content rising would undoubtedly indirectly promote the PA and NO synthesis, thus improved the tomato resistance under copper stress.

copper stress; tomato; nitric oxide; L-Arginine; polyamine

国家自然科学基金项目(31201619)

王建(1987-)，男，硕士研究生；研究方向：植物营养机理与调控；E-mail：wj308119@sina.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: xiumincui@sdau.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140425002

2014-04-25 录用日期：2014-08-17

1673-5897(2015)3-112-11

X171.5

A

崔秀敏(1977—)，女，博士，副教授，主要研究方向为植物营养机理与调控。

王建，窦巧惠，于世欣, 等. 外源NO对Cu胁迫下番茄幼苗L-精氨酸代谢的影响[J]. 生态毒理学报，2015, 10(3): 112-122

Wang J，Dou Q H, Yu S X, et al. The effect of exogenous NO on L-arginine metabolism in tomato seedlings under copper stress [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 112-122 (in Chinese)