食蚊鱼(Gambusia affinis)cat、gapdh和gst基因的克隆及其在生态毒理学中的应用

欧瑞康, 武小燕, 库培佳, 王兰, 苏甜, 梁惜梅, 聂湘平

暨南大学生命科学技术学院水生生物研究所 生态系，广州510632



食蚊鱼(Gambusia affinis)cat、gapdh和gst基因的克隆及其在生态毒理学中的应用

欧瑞康, 武小燕, 库培佳, 王兰, 苏甜, 梁惜梅, 聂湘平*

暨南大学生命科学技术学院水生生物研究所 生态系，广州510632

根据Ensembl、Genbank登录的鱼类cat、gapdh和gst基因的CDS序列设计普通PCR扩增引物，寻找食蚊鱼的cat、gapdh和gst基因的cDNA片段，并根据定量引物设计要求设计出相应的SYBR Green I荧光定量RT-qPCR引物，建立了食蚊鱼cat、gapdh和gst基因的SYBR Green I荧光定量RT-qPCR方法。该方法在104～108数量级范围内有良好线性关系(R=0.999～1.000)；熔解曲线显示扩增产物特异性良好，均为单一峰值；质粒标准品最高浓度与最低浓度的批内试验变异系数与批间试验变异系数均低于2%。利用该方法监测和评价环境污染物对水生生物的影响，选择了水体中常见典型药物污染物——双氯芬酸，研究其对食蚊鱼抗氧化基因表达的影响。结果表明，雌性食蚊鱼暴露在不同浓度双氯芬酸钠(0.005、0.05、0.5和5 mg·L-1)24 h后，其肝脏cat、gapdh和gst的mRNA呈现显著变化，相对于对照组，在低浓度0.005 mg·L-1时，cat与gstmRNA的表达量均有极显著上升(p<0.01)，而其它浓度均极显著下降(p<0.01)。试验表明该方法具有快速、精确、灵敏度高的优点，可为利用该类小型鱼类的原位污染物的生物监测和生态毒理评价提供有力的技术支持。

食蚊鱼； cat; gapdh; gst；实时荧光定量PCR；双氯芬酸

常规的色谱、分光光度法等化学分析方法是检测水体中污染物的最主要的手段之一，这些方法能够检测出水体污染物的类别和含量，但却无法准确反映污染物对生物机体产生的毒性效应。生物机体曝露于环境污染物时，机体会产生一些生理、行为、生化等的变化，通过检测这些变化可观测和衡量环境污染物对生物的影响。因此利用生物监测技术可以弥补常规化学分析技术手段的不足，也是环境污染监测的常用技术手段之一。近年来，国内许多研究者认识到利用活体动物开展毒性测试对保护环境、改善水处理工艺的重要性，相关的研究工作也逐年增加，而生物毒性测试方法包括鱼类、溞类、发光菌等的急性或慢性毒性测试[1]。目前鱼类已经作为环境污染的指示生物之一用来评估水体系统的质量[2]。而在众多检测方法当中，分子技术检测方法可以在生物体暴露于环境污染物的早期及时检测污染物的毒性效应。

环境污染物进入生物体内后，通常会在P450酶系的参与下，进行氧化、还原、水解等代谢过程，使得外来污染物极性增加，导致污染物的毒性减弱。而在污染物分子被修饰的过程中往往会因此产生活性中间产物和自由基。正常情况下，产生的自由基或活性中间产物会在抗氧化酶及Ⅱ相代谢相关酶的作用下被清除。检测这些酶的响应变化，可有效地反映各种外来物质对生物产生的毒性影响[3]。本文涉及到的过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)正是生物体内最常见的抗氧化酶和Ⅱ相代谢酶。其中CAT是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，GST其主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，并在被分解后排出体外，从而达到解毒的目的。甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)是生物体内能量代谢中一个关键的限速酶，也是大多数生物体内在一般情况下稳定表达的管家基因，常被用作荧光定量PCR的内参基因。

生态毒理学中常用作实验的模式鱼类有斑马鱼、青鱂、虹鳟和剑尾鱼等，但这些鱼类对生存环境有一定的要求，在我国自然水体中不易采集，难以反映自然环境中各类污染物真实暴露影响。而食蚊鱼在我国多数淡水环境中能够采集到，具有一定的代表性。早期为了控制疟疾而大量人工投放食蚊鱼到各种淡水水体中，由于其较强的繁殖能力和较强的适应能力，已经成为我国南方淡水河流常见优势的外来入侵种[4]，在池塘、水沟、低洼地等小水体中普遍分布，食蚊鱼对温度和盐度的变化有较强的适应能力，容易捕捞和实验室驯养，目前已作为一种指示生物用于生态毒理试验[5]。根据文献检索，有关食蚊鱼的cat，gapdh和gst三种基因用于荧光定量PCR检测尚未见报道。

大量研究显示，越来越多被排放到环境中(特别是在水环境中)的微量残留药物已成为一类新的环境污染物。目前在水环境中至少可以检出六十多种药物，如镇痛药、抗生素、抗癫痫剂等。双氯芬酸钠是一种衍生于苯乙酸类的非甾体消炎药(NSAID)，其疗效好，副作用少，被广泛用于消炎镇痛治疗。由于在水环境中的残留药物含量很低(通常在μg·L-1甚至ng·L-1水平)，对这类污染物有效监测需要依赖于灵敏度高的检测方法，如质谱仪等[6]。但利用生物检测仍不失为一种灵敏有效的补充手段之一。

本研究通过克隆食蚊鱼cat、gapdh和gst基因的cDNA中间序列，依据序列设计特异性引物，建立cat、gapdh和gst基因mRNA水平的实时荧光定量PCR检测方法；并检测不同浓度双氯芬酸钠对食蚊鱼mRNA表达量的影响，从而为利用食蚊鱼作为一种快速、敏感的污染物监测指示生物提供科学基础。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 主要试剂及仪器

Trizol RNA提取试剂盒(Invitrogen公司，上海)；PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRa Taq、DL500和DL1000 DNA Marker、pMD 18-T质粒载体、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)均为大连TaKaRa宝生物公司；胶回收试剂盒(OMEGA公司，美国)；DH5α质粒(康为世纪生物科技有限公司，北京)；质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)；双氯芬酸钠(纯度98.0%，日本东京化成TCI工业株式会社)；tBHQ(纯度>98.0%，日本东京化成TCI工业株式会社)。

CFX Connect荧光定量PCR仪(BIORAD公司，美国)；Ingenius L凝胶成像仪(SYNGENE公司，英国)；ABI Veriti 96孔梯度PCR仪(Applied Biosystems公司，美国)；恒温水浴锅(XMT4302-C，上海)；恒温摇床(ZHWY-200D，上海)；超净工作台(HD-650，苏州)；移液枪(Eppendorf公司，德国)；Nanodrop 2000(Thermo公司，美国)。

1.2 食蚊鱼cat、gapdh和gst基因mRNA中间序列引物设计

cat基因mRNA参考ENSEMBL、GenBank登陆的新月鱼、青鳉、花斑溪鳉，登录号分别为ENSXMAT00000019230、KC138555.1、EU116026.1保守区域CDS 序列，gapdh基因mRNA则参考ENSEMBL、GenBank登陆的新月鱼、花斑溪鳉、条石鲷，登录号分别为ENSXMAT00000011486、FJ438822.1、EU828449.1保守区域CDS序列，gst基因mRNA则参考ENSEMBL、GenBank登陆的新月鱼、剑尾鱼、条石鲷、鳜鱼，登录号分别为ENSXMAT00000006938、JN256943.1、GU938678.1、EU719618.1保守区域CDS序列，设计出如表1所示引物，引物交由北京中美泰和生物技术有限公司合成。引物用高压蒸汽灭菌的超纯水溶解至10 μmol·L-1，-20 ℃保存。

1.3 实验动物暴露及组织样品采集

实验用食蚊鱼来自广州珠江水产研究所；诱导剂tBHQ (叔丁基对苯二酚，是一种油溶性抗氧化剂，广泛应用在食物添加剂中，常用作机体抗氧化反应试验的模式诱导物)用曝气过的自来水配制成0.2 mg·L-1的暴露液。实验在盛有7 L暴露液的10 L玻璃缸中进行，对食蚊鱼(雌性个体)暴露12 h，解剖采集肝脏，立即提取RNA。

1.4 总RNA的提取及cDNA的合成

食蚊鱼的肝脏RNA提取方法按Invitrogen公司TRIZOL Reagent说明书进行，剩余样品-70 ℃保存。然后cDNA反转录按TaKaRa PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。

1.5 cat、gapdh和gst目的基因中间序列片段的扩增、克隆与鉴定

1.5.1 目的基因中间片段PCR扩增

将反转录合成的cDNA作为模板，进行普通PCR扩增。反应体系为双蒸水17.25μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，cDNA模板0.75 μL，上下游引物各1 μL，rTaq酶0.5 μL，反应总体系为25 μL。PCR扩增反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，进行32个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃结束反应并保存。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，并用紫外凝胶成像仪检测电泳结果。将有条带的凝胶切下并用胶回收试剂盒回收。

1.5.2 目的基因中间片段的连接、转化

将回收得到的产物与pMD 18-T质粒载体连接，加入4 μL胶回收产物，1 μL pMD 18-T质粒载体，5 μL Solutiong I，用移液枪轻轻吹打混匀，放冰箱4 ℃过夜连接。将10 μL连接过夜的质粒加入到100 μL感受态中，轻轻混匀。转化方法按TaKaRaE. coli Competent Cells DH5α质粒转化说明书进行，加入预温的液体LB培养基500 μL，37 ℃ 200 rpm恒温摇床震荡培养45 min。将管内菌液混匀，吸取100 μL涂布于含有100 μg·mL-1氨苄青霉素的LB固体培养基上，放置于恒温培养箱37 ℃培养20 min，待平板干燥后倒置平板，37 ℃静置过夜培养。

表1 用于寻找食蚊鱼cat、gapdh和gst cDNA中间片段引物序列

1.5.3 阳性克隆的PCR鉴定与测序

挑取平板上单一菌落，接种到100 μg·mL-1氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 ℃ 180 rpm恒温摇床震荡培养7～12 h。从菌液中吸取2 μL作为模板进行PCR扩增，凝胶成像有条带的样品送去华大基因公司测序。

1.6 食蚊鱼cat、gapdh和gst基因实时荧光定量RT-qPCR方法的建立

1.6.1 实时荧光定量PCR引物设计与合成

根据上面得到的食蚊鱼cat、gapdh和gst基因cDNA序列，参照荧光定量PCR引物设计要求设计出如表2所示的下荧光定量引物：

表2 用于检测食蚊鱼cat、gapdh和gst相对表达量的引物序列

引物交由北京中美泰和生物技术有限公司合成。引物用高压蒸汽灭菌的超纯水溶解至10 μmol·L-1，-20 ℃保存。

1.6.2 cDNA的合成

cDNA合成方法按1.4进行。

1.6.3 cat、gapdh和gst 基因cDNA目的片段的扩增、克隆及鉴定

1.6.3.1 目的片段的PCR扩增

以反转录的cDNA为模板，分别以ctf与ctr、ghf与ghr、gtf与gtr为引物进行普通PCR扩增。反应总体系与1.5.1一样，PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性10s，60 ℃退火40 s，72 ℃ 1 min，进行32个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃结束反应。PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。按OMEGA胶回收试剂盒按说明书回收PCR扩增产物。

1.6.3.2 转化、克隆与鉴定、测序

目的片段的转化、克隆与鉴定、测序方法与1.5.2和1.5.3相同。

1.6.4 质粒标准品的制备

含目的片段重组质粒的大肠杆菌经扩大培养及菌液测序鉴定后，按天根质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用Thermo Nanodrop 2000核酸蛋白质分光光度计检测浓度，检测出cat、gapdh和gst质粒标准品的浓度分别为：73.5 ng·μL-1、81 ng·μL-1和63 ng·μL-1，根据公式换算成拷贝数分别为：2.43×1010、2.63×1010和2.07×1010。将重组质粒标准品原液进行连续10递增稀释，制备的5个浓度重组质粒标准品，分别为(2.43、2.63、2.07×)108、107、106、105、104拷贝数·μL-1，-20 ℃保存备用。

1.6.5 标准曲线的建立

以重组质粒为模板,并分别以与重组质粒对应的引物作为扩增引物，进行 SYBR Green I实时荧光定量PCR，反应总体积为25 μL：SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 12.5 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL，质粒标准品2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。在60 ℃延伸时采集荧光信号。反应结束后，进行熔解曲线的测定,反应条件为:95 ℃ 10 s，接着温度以0.5 ℃/5 s的速率从60 ℃递增到95 ℃，连续测定样品的荧光强度以得到熔解曲线。每个样品做3个重复。

1.6.6 重复性试验

在cat、gapdh和gst质粒标准品中取最高与最低浓度进行荧光定量PCR反应，每个浓度设3个重复，计算Ct值的变异系数，检验批内重复性；同时对上述样品做3次测定(间隔1天)，计算Ct值的变异系数，检验批间重复性。

1.6.7 双氯芬酸钠暴露实验

设置双氯芬酸钠暴露液浓度组：0.005、0.05、0.5和5 mg·L-1，每个浓度设3个平行，并加设一个自来水空白对照组，试验在10 L的水族箱中进行，内盛7 L暴露液，每个水族箱放3条雌性食蚊鱼，实验期间不充氧，不投喂饵料，实验开始后，在24 h时从每个浓度三个平行的水族箱中分别取雌鱼一条，解剖取肝脏进行总RNA的提取，并且反转录和荧光定量PCR检测。

1.7 数据处理和统计分析

本次实验使用是相对定量方法中的2-ΔΔCt法，利用公式F=2-[(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)](其中Ct1为处理样品目的基因的临界循环数，Ct2为处理样品内参基因的临界循环数，Ct3为对照样品目的基因的临界循环数， Ct4为对照样品内参基因的临界循环数，F为处理样品目的基因经过校正后的相对表达量)计算定量结果，内参为gapdh，mRNA的相对表达水平使用单因素方差分析法来检验，统计检验使用SPSS 22。

2 结果(Results)

2.1 食蚊鱼cat、gapdh和gst cDNA中间序列及同源性分析

图1 cat, gapdh和gst中间序列片段电泳结果M: DL1000 Marker; 1,2: cat; 3,4: gapdh; 5,6: gstFig. 1 Performance of electrophoresis of cat, gapdh andgst intermediate fragments

图2 食蚊鱼cat, gapdh和gst cDNA中间片段a: cat; b: gapdh; c: gstFig. 2 cDNA sequences of cat, gapdh and gst from the Gambusia affinis

用1.2所述的引物进行普通PCR扩增，凝胶电泳结果如图1显示，在500～1 000 bp处都有条带，且与预期的片段大小基本相符。

通过对食蚊鱼cat、gapdh和gst基因cDNA中间片段克隆结果进行测序，结果如图2所示，显示克隆得到的cDNA中间片段的大小分别为962 bp、608 bp和836 bp，得到的序列长度和预期的基本吻合。将整理好的食蚊鱼核酸测序结果通过BLAST进行比对，找到其它物种相应的CDS序列，结果如表3所示，食蚊鱼cat、gapdh和gst的核酸与氨基酸序列均与花斑剑尾鱼的核酸与氨基酸序列同源性最高，cat、gapdh和gst核酸同源性分别为98%、98%和96%，氨基酸同源性分别为98%、99%、94%。利用clustal X和MEGA 5.0进行序列分析和与其它鱼类进行比对，结果如图3所示，分析结果与BLAST结果基本一致，食蚊鱼的CAT、GAPDH和GST的氨基酸序列与花斑剑尾鱼相对应的氨基酸序列处于同一进化树分支，初步确定该序列为目的基因中间片段序列。

表3 食蚊鱼与其它物种cat、gapdh和gst的核酸序列与氨基酸序列的同源性比较

图3 用邻接法构建的食蚊鱼CAT, GAPDH和GST氨基酸序列系统树a: CAT; b: GAPDH; c: GSTFig. 3 Phylogenic tree of Gambusia affinis based on CAT, GAPDH and GST amino acidsequences by neighbor-joining method

2.2 质粒标准品的制备、标准曲线的建立和线性检测范围

将食蚊鱼肝脏总RNA经反转录后合成cDNA，加入荧光定量PCR引物再进行普通PCR扩增，得到cat、gst和gapdh的目的条带长度分别为72 bp、78 bp和136 bp，电泳图如图4。目的条带进行凝胶回收后，进行目的片段克隆、鉴定和测序。测序结果经序列比对，证明扩增的片段是目的片段。说明成功构建目的片段重组质粒，可以作为SYBR Green I实时荧光定量PCR的阳性质粒标准品。

不同浓度食蚊鱼cat、gapdh和gst基因质粒标准品的SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线(见图5a与b)。由图显示，食蚊鱼cat、gapdh和gst基因实时荧光定量PCR标准曲线的线性范围均达到5个数量级，重组质粒浓度分别在(2.43、2.63、2.07×)108、107、106、105、104拷贝数·μL-1之间，其对数与相应的Ct值均有良好相关性，相关系数(R2)分别为：0.999、1.000、0.999。由Bio-Rad CFX Manager 3.0软件计算出标准曲线的扩增效率分别为：99.7%、94.3%、90.2%。三个基因的熔解曲线(见图5c)均为单一峰，峰值熔解温度分别为79.5 ℃、89.0 ℃、82.0 ℃,说明扩增产物无引物二聚体及非特异性扩增，引物设计合理性好和特异性高。

图4 荧光定量引物PCR扩增产物电泳结果M: DL500 Marker; 1,2: gst; 3,4: gapdh; 5,6: catFig. 4 Performance of electrophoresis of the RT-qPCR primers amplification products

图5 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCRa: 扩增曲线(RFU:荧光值; Cycle:循环数); b: 标准曲线(Cq: Ct值; Log starting quantity: 起始模板的对数值); c: 溶解曲线Fig. 5 SYBR Green I RT-qPCR a: Amplification curve; b: Standard curve; c: Melt curve

2.3 可重复性评价结果

分别将食蚊鱼cat、gapdh和gst基因质粒标准品的最低与最高浓度进行批内检测和批间检测，计算出批内变异系数和批间变异系数，结果见表4。

由表中可见，cat、gapdh和gst标准阳性质粒批内试验CV分别为：0.35%与1.36%、0.54%与1.24%、0.90%与0.65%，组间试验CV为0.37%与0.13%、0.52%与0.21%、0.49%与1.32%，批内批间变异系数均小于2%表明该方法具有良好的可重复性。

2.4 双氯芬酸钠暴露对食蚊鱼cat和gst mRNA表达的影响

雌性食蚊鱼暴露于双氯芬酸钠24 h之后，cat、gst mRNA表达量变化如图6a和b所示，在最低浓度0.005 mg·L-1时表达量极显著上升(p<0.01)，但是随着双氯芬酸钠浓度的增加，表达量呈现总体下降趋势，与对照组相比存在极显著差异(p<0.01)。

3 讨论(Discussion)

实时荧光定量PCR是近年来发展起来的一种定量核酸分子的新技术。与普通PCR相比，实时荧光定量PCR最主要的优点是可以对DNA及mRNA表达水平进行准确的定量分析[7]。实时荧光定量现已广泛应用于分子医学、生物技术、微生物学和诊断学上的定量分析，并成为mRNA定量的一种常规方法之一[8]。实时荧光定量PCR主要分为绝对定量和相对定量，前者主要应用于检测给定数量的样品中核酸的量。相对定量的分析结果是试验组和对照组中的一个靶基因的相对比率。相对定量主要用于mRNA的表达量分析，通过同时测定实验组和对照组的目的基因和内参基因表达量，用内参基因归一化来获得目的基因相对于参照基因的表达指数，试验组与对照组目的基因表达指数的比值就是目的基因的相对表达量，反映试验组目的基因表达的变化[9]。

越来越多研究表明，不同的外源化学物质进入生物体内后可引起氧化应激、基因毒性应激和蛋白质毒性应激等反应，从而激活生物细胞内解毒代谢系统，以维持生物体内环境的相对稳定[10]。而检测参与这些反应的各种解毒代谢酶类的响应变化可部分反映外源污染物对生物的影响。其中抗氧化酶是其中最常用的一类生物标记物。CAT和GST是抗氧化应激和Ⅱ相代谢密切相关的两种常见的酶。以往研究大多集中在检测其酶活性来反映外源物质对机体的损伤程度，但这种方法实验结果数据有较大的差异，可重复性低，灵敏度低，效果不是很理想。而利用分子技术手段在基因水平上检测这些解毒酶的响应，灵敏度较高，也可获得较好的重复性。

表4 标准品批内批间重复性(n=3; x±SD)

图6 不同浓度双氯芬酸钠对食蚊鱼cat, gst mRNA表达的影响(a:cat相对表达水平; b:gst相对表达水平)Fig. 6 Effects of different concentrations of diclofenac sodium salt on the expression of cat andgst mRNA in female Gambusia affinis(a: cat relative expression level; b: gst relative expression level)

双氯芬酸钠能引起脊椎动物肝损伤，但其发病机制尚不清楚。有研究表明，氧化应激、线粒体功能损伤、能量代谢障碍和细胞凋亡可能与双氯芬酸钠引起肝损伤有关。其中氧自由基的产生是双氯芬酸钠引起肝细胞功能损伤的主要原因，SOD(超氧化物歧化酶)和GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)是机体内重要的抗氧化系统，通过抑制脂质过氧化反应，保护细胞膜结构和功能完整，双氯芬酸钠能使GSH含量和SOD、GSH-Px活性水平明显降低，表明双氯芬酸钠能导致肝损伤与氧化损伤机制有关[11]。而CAT和GST也是机体抗氧化系统中的重要的组成部分，且与SOD和GSH关系密切，本实验结果显示双氯芬酸钠在低浓度时(0.005 mg·L-1)对cat和gst的mRNA表达量有上调作用(p<0.01)，但随着浓度的增加，两种基因的表达量有下降趋势。表明食蚊鱼肝脏受到一定的损伤。GST具有消除体内自由基和解毒双重功能，是一种重要的解毒酶，能催化GSH与许多次级底物结合，包括脂质过氧化的次级产物，从而解除外源性污染物的毒性[12]。gst mRNA表达量的升高与双氯芬酸钠导致的氧自由基的产生有关，但随着浓度的升高，氧自由基的含量逐渐增加，抑制了GST酶的活性，这种GST活性水平在低浓度污染物暴露呈现上升而高浓度暴露则下降的变化趋势在水生生物对污染物的暴露中有报道[13]。而CAT同样作为抗氧化酶，其变化与GST类似，表明cat和gst mRNA表达量均与双氯芬酸钠的浓度相关[14]。因此，cat和gst的mRNA响应变化可以作为指标参数用于双氯芬酸钠的毒性监测和评价。

致谢：感谢暨南大学生命科学技术学院聂湘平教授的帮助和支持。

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Cloning ofcat,gapdhandgstGenes ofGambusiaaffinisand Its Application in Ecotoxicology

Ou Ruikang, Wu Xiaoyan, Ku Peijia, Wang Lan, Su Tian, Liang Ximei, Nie Xiangping*

Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes, Department of Ecology, College of Life and Technique Science, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Received 13 April 2014 accepted 26 September 2014

According to the coding sequences of cat, gapdh and gst genes in fish species published in Ensembl and GenBank, three pairs of primers were designed to find the cDNA sequences of cat, gapdh and gst in mosquitofish (Gambusia affinis).The primers for SYBR Green I real-time quantitative PCR was employed based upon the design requirements of quantitative primer. A new method of SYBR Green I real-time quantitative PCR for determination of cat, gapdh and gst genes in G. affinis was successfully established. The results showed that a good linear relationship existed in the range from 104to 108copies·μL-1(R=0.999～1.000) and the melt curve exhibited good specificity of amplification products. The co-efficiencies of variation for both intra- and inter-experimental reproducibility were less than 2%. Furthermore, in order to validate and assess the utilization and feasibility of the new method in ecotoxicology, diclofenac, a typical pharmaceutical detected frequently in water, was employed to investigate its effects on the expression of antioxidant genes of G. affinis. Results showed that the cat and gst mRNA expressions were very significantly induced (P<0.01) in 0.005 mg·L-1when female individuals were exposed to diclofenac sodium salt (0.005～5 mg·L-1) for 24 h, but decreased very significantly (P<0.01) with the increasing concentrations. It indicates that this new method is feasible, accurate and highly sensitive, and may provide a methodological basis for the utilization of mosquitofish as a sentinel in molecular eco-toxicological assessment of environmental pollution.

Gambusia affinis; cat; gapdh; gst; real-time quantitative PCR; diclofenac

国家科技支撑计划课题(2012BAC07B05, 20612033)； 暨南大学科研培育与创新基金(21611609)

欧瑞康(1988-)，男，硕士研究生，研究方向：环境生物学，E-mail: ouruikang@126.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: txpnie@jnu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140413003欧瑞康, 武小燕, 库培佳, 等. 食蚊鱼(Gambusia affinis)cat、gapdh和gst基因的克隆及其在生态毒理学中的应用[J]. 生态毒理学报， 2015, 10(3): 83-92

2014-04-13 录用日期：2014-09-26

1673-5897(2015)3-083-10

X171.5

A

聂湘平(1966-)，男，博士，教授，主要从事水环境生态毒理学研究。

Ou R K, Wu X Y, Ku P J, et al. Cloning of cat, gapdh and gst genes of Gambusia affinis and its application in ecotoxicology [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 83-92 (in Chinese)