7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性比较研究

马丽，吴民耀，王宏元

陕西师范大学秦巴山区可持续发展协同创新中心 西安 710119



7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性比较研究

马丽，吴民耀，王宏元*

陕西师范大学秦巴山区可持续发展协同创新中心 西安 710119

为评估Cu2+，Hg2+，Cr6+，Cd2+，Li+，Al3+和Co2+7种金属离子对中国林蛙(Rana Chensinensis)和中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪的急性毒性效应，采用生物毒性试验方法对中国林蛙和中华大蟾蜍36期蝌蚪，进行上述7种金属离子的急性毒性试验，分别测定了这7种金属离子对中国林蛙蝌蚪和中华大蟾蜍蝌蚪的半数致死浓度(LC50)。此外，分析了中国林蛙和中华大蟾蜍36期蝌蚪的肥满度、肝指数等形态指标。结果显示，Cu2+、Hg2+、Cr6+、Cd2+、Li1+、Al3+、Co2+对中国林蛙蝌蚪的96 h-LC50分别为0.270 mg·L-1、0.803 mg·L-1、2.375 mg·L-1、7.351 mg·L-1、11.273 mg·L-1、17.265 mg·L-1和20.973 mg·L-1。对中华大蟾蜍蝌蚪的96 h-LC50分别0.593 mg·L-1、0.593 mg·L-1、2.827 mg·L-1、2.592 mg·L-1、12.656 mg·L-1、14.020 mg·L-1和57.435 mg·L-1。中国林蛙蝌蚪对Cu2+、Cr6+、Li+、Co6+4种金属离子的敏感性相对较高，而中华大蟾蜍蝌蚪对Hg2+、Cd2+、Al3+3种金属离子的敏感性相对较高。形态指标的差异是中国林蛙与中华大蟾蜍蝌蚪对同一金属离子敏感性差异的原因之一。

中国林蛙蝌蚪；中华大蟾蜍蝌蚪；金属离子；LC50

随着人类对煤炭、石油和天然气等能源消耗的持续增长，以及人类的大量活动如矿山开采，金属冶炼、加工，农药化肥的使用等均造成环境中重金属含量增加[1]。重金属以多种物理和化学形态存在于水体、土壤和大气等环境中，并在环境中产生迁移和积累[2-3]，其中，水体重金属污染是当今世界上最严重的环境问题之一。水体重金属污染使得水生生态系统长期处于一种被干扰状态，影响水生生物的生存繁殖及生态系统的结构，并进而影响到人类的生活和健康。

目前，重金属离子对水生生物的毒性研究主动要集中于鱼类、双贝类和两栖动物[4-7]。两栖动物是联系水生和陆生环境的关键物种，在生态系统中占有重要的位置，其胚胎和幼体的发育均在水域中进行，水域污染物会直接影响它们的发育和变态[4,8]。两栖动物幼体鳃和皮肤的渗透性强，对水质的反应极为敏感[9]，是水体污染生物监测中的重要的指示动物[10-11]。虽然有关重金属离子对两栖动物的毒性研究已有一些相关报道，但是就不同物种对多种金属离子敏感差异的比较研究还较匮乏。

中国林蛙(Rana chensinensis)和中华大蟾蜍(Bufo gargarizans) 均是我国的广布物种，以二者为对象进行毒理学研究更有利于将实验室研究与野外监测相结合，从而为环境污染的生态风险评估提供更为客观的信息。本试验以中国林蛙(R. Cnensinensis)和中华大蟾蜍(B. gargarizans)蝌蚪为试验动物，研究铜离子(Cu2+)、汞离子(Hg2+)、铬离子(Cr6+)、镉离子(Cd2+)、锂离子(Li+)、铝离子(Al3+)和钴离子(Co2+)对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性，以评估7种金属离子的毒性效应，及不同物种对金属离子污染的敏感差异性，旨在丰富金属离子的水生生物毒理学基础数据，为水生生态系统保护标准的制定提供参考信息。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

中华大蟾蜍卵和中国林蛙卵均于2013年3月采自秦岭北坡的西安市长安区大峪水库周围小水潭(109°06′52″E，34°01′00″N)，海拔723 m。将卵带回实验室，于室温下孵化为蝌蚪，根据Gosner[12]的分期标准对蝌蚪进行分期，36期蝌蚪后肢五趾分开[13]，肉眼可见，易于分期辨认，且其各部形态发育基本成熟稳定[14]，因此试验选取发育至36期的蝌蚪作为试验材料。

1.2 试验试剂及溶液配制

试验所用化合物硝酸铝(Al(NO3)3)、铬酸铵((NH4)2CrO4)、氯化汞(HgCl2)、硝酸钴(Co(NO3)2)、硝酸铜(Cu(NO3)2)、氯化锂(LiCl)、氯化镉(CdCl2)为分析纯(纯度≥99%, 购自Sigma 化学试剂公司)，试验前用双蒸水配制成离子质量浓度为1 000 mg·L-1的母液，置于4 ℃环境中保存备用，试验开始时稀释为所需金属离子质量浓度的暴露溶液。

1.3 试验条件

对中国林蛙蝌蚪和中华大蟾蜍蝌蚪采用室温下曝气3 d的自来水作为试验用水，试验所用容器为40 cm×20 cm×20 cm (长×宽×高)的玻璃缸，每容器盛试验液4 L，随机放入36期的中国林蛙蝌蚪和中华大蟾蜍蝌蚪各30 例。试验用水pH 值约7.0，硬度(CaCO3)为(90±5) mg·L-1，水温为(18±2)℃，自然光照周期条件下培养，试验期间不投食。为保证试验质量浓度的准确性，每24 h 更换全部试验液。

1.4 试验方法

选择几种较大的金属离子浓度范围进行预实验，根据最小的全致死浓度和最大的零致死浓度确定正式试验的浓度范围。7种金属离子均设置8个暴露浓度组(表1)，另设自来水空白对照组，每组均为30 只蝌蚪。为避免蝌蚪发生同类相食现象及死亡蝌蚪毒性分泌物对正常蝌蚪产生影响[15]，暴露后前12 h连续观察，之后每间隔4 h观察1次。当蝌蚪沉于水底,用玻璃棒多次刺激其尾部无反应时则判断为死亡，及时将死亡蝌蚪捞出，记录24 h、48 h、72 h、96 h死亡蝌蚪的数目。

1.5 形态学指标测量与分析

采用电子游标卡尺(桂林广陆电子数显游标卡尺，测量范围150 mm，精确度0.01 mm)测定蝌蚪全长、体长和尾长；采用Sartorius BS124S型电子天平(精确度0.001 g)测定蝌蚪体质量；在Zeiss Discovery V12型体视显微镜下剥离出蝌蚪的肝脏，通过电子天平测定肝质量。肥满度和肝指数分别根据下列公式计算：

表1 7种金属离子的急性毒性暴露浓度

肥满度=体质量/全长×100

肝指数=肝质量/体质量×100[16]

1.6 数据处理与分析

所有试验数据均采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。采用概率单位法求得7种金属离子分别对中国林蛙蝌蚪和中华大蟾蜍蝌蚪的半数致死浓度(LC50)及95%置信区间[17-18]。安全浓度(SC)参照SC=0.01×96 h-LC50计算[19]。蝌蚪肝指数以平均值±标准差表示，数据采用t检验(t-test)进行比较分析 (P<0.05 表示差异显著, P<0.01 表示差异极显著)。

2 结果(Results)

2.1 7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性

急性毒性试验过程中，对照组蝌蚪游动正常，无死亡现象，试验组蝌蚪的死亡个数均随着金属离子质量浓度的增加而增加，并与暴露时间的延长呈正相关。7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50和96 h-LC50如表2所示。

7种金属离子对中国林蛙蝌蚪的24 h-LC50、48h-LC50、72 h-LC50和96 h-LC50大小排列顺序均为：Co2+>Al3+>Li+>Cd2+>Cr6+>Hg2+>Cu2+。试验所得Cu2+、Hg2+、Cr6+、Cd2+、Li+、Al3+和Co2+对中国林蛙蝌蚪的96 h-LC50分别为0.270 mg·L-1、0.803 mg·L-1、2.375 mg·L-1、7.351 mg·L-1、11.273 mg·L-1、17.265 mg·L-1和20.973 mg·L-1，依据安全浓度计算公式，得出上述7种金属离子对中国林蛙蝌蚪的安全浓度分别为0.00270 mg·L-1、0.00803 mg·L-1、0.023 75 mg·L-1、0.07351 mg·L-1、0.11273 mg·L-1、0.17265 mg·L-1和0.20973 mg·L-1。

7种金属离子对中华大蟾蜍蝌蚪24 h-LC50和48h-LC50大小排列顺序为：Co2+>Li+>Al3+>Cd2+>Cr6+>Hg2+>Cu2+，72 h-LC50和96 h-LC50大小排列顺序分别为：Co2+>Li+>Al3+>Cr6+>Cd3+>Hg2+>Cu2+，Co2+>Al3+>Li+>Cr6+>Cd2+>Hg2+= Cu2+。试验所得Cu2+、Hg2+、Cr6+、Cd2+、Li+、Al3+和Co2+对中华大蟾蜍蝌蚪的96 h-LC50分别0.593 mg·L-1、0.593 mg·L-1、2.827 mg·L-1、2.592 mg·L-1、12.656 mg·L-1、14.02 mg·L-1和57.435 mg·L-1，依据安全浓度计算公式，得出上述7种金属离子对中华大蟾蜍蝌蚪的安全浓度分别为0.00593 mg·L-1、0.00593 mg·L-1、0.02827 mg·L-1、0.02592 mg·L-1、0.12656 mg·L-1、0.14020 mg·L-1和0.57435 mg·L-1。

2.2 7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的毒性比较

根据所获得的7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的安全浓度，分析比较7种金属离子对两个不同物种蝌蚪的毒性大小，结果见图1。由图可知，7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的毒性大小表现一致，即Cu2+和Hg2+对蝌蚪的毒性作用最大，Cr6+和Cd2+次之，Li+、Al3+和Co2+的毒性作用相对较小。但是，通过安全浓度的比较可知，Hg2+，Cd2+，Cr6+和Al3+对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性作用较中国林蛙蝌蚪大，而Cu2+、Li+和Co2+对中国林蛙蝌蚪的毒性较中华大蟾蜍蝌蚪的毒性大。

表2 7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的LC50

图1 7种金属离子对中国林蛙蝌蚪(A)和中华大蟾蜍蝌蚪(B)的安全浓度Fig. 1 Safe concentrationof 7 metal ions for R. chensinensis (A) and B. gargarizans (B) tadpoles

图2 中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪体重全长(A)、尾长全长(B)散点图Fig. 2 Distribution of weight in function of total length (A) and tail length in function of total length (B)of R. chensinensis and B. gargarizans tadpoles

2.3 中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的形态指标比较

由图2数据计算可知，中华大蟾蜍蝌蚪的肥满度为0.8±0.01，中国林蛙的肥满度为0.7±0.02。与中华大蟾蜍蝌蚪相比，中国林蛙蝌蚪的尾长较长。图3显示，中国林蛙蝌蚪和中华大蟾蜍蝌蚪的肝指数分别是3.6±0.2和2.5±0.1，中国林蛙蝌蚪的肝指数显著大于中华大蟾蜍蝌蚪的肝指数(P<0.05)。

3 讨论(Discussion)

根据急性毒性试验所获得的LC50可以有效地评估水体化学污染物对水生生物的毒性效应。本试验得出Cu2+、Cd2+等7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的毒性大小均为：Cu2+和Hg2+最大，Cr6+和Cd2+次之，Li+、Al3+和Co2+相对较小，表明蝌蚪对不同金属离子的敏感性有差异。李春瑜[20]等报道，Cu2+对海陆蛙蝌蚪的毒性大于Cd2+。Sunita[21]的研究表明，Cu2+、Zn2+、Ni3+，Cd2+四种金属离子中，Cu2+对紫贻贝胚胎的毒性最强，Cd2+最弱。Martin 等[22]研究表明，Hg2+和Cu2+对贻贝胚胎的毒性最大，而Cd2+和Cr6+次之。相关资料显示，Cu2+进入细胞后与Ca2+、Zn2+等二价阳离子竞争与酶的结合部位,导致酶活性的改变，进而诱导一系列生化反应异常，引起代谢紊乱[23-25]；Cr6+的毒性主要是通过其强氧化性和渗透生物膜的能力所引起[26]，而在两栖类体内Cr6+可被转变为毒性较弱的 Cr3+[27]，分析认为，蝌蚪对不同金属离子敏感性的差异与不同类型金属离子在蝌蚪体内的代谢机制和毒性机理存在差异有关。

图3 中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的肝指数*表示二者之间有显著差异(P<0.05)Fig. 3 Liver index of R. chensinensis andB. gargarizans tadpoles Asterisk indicates statistically significant difference compared to R. chensinensis(P<0.05)

本研究结果表明，Cu2+对中国林蛙蝌蚪的24 h、48 h、72 h、96 h-LC50分别为0.480 mg·L-1、0.467 mg·L-1、0.359 mg·L-1和0.270 mg·L-1。此外，试验结果表明， Cu2+和Hg2+对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性相同。上述结果与已有研究结果不完全一致，例如，石戈等[28]报道，Cu2+对中国林蛙蝌蚪24 h、48 h、72 h-LC50分别为0.131 mg·L-1，0.105 mg·L-1，0.038 mg·L-1；王寿兵等[29]的研究表明，Cu2+对中国林蛙蝌蚪的24 h、48 h、72 h、96 h-LC50分别为8.13 mg·L-1、7.00 mg·L-1、6.38 mg·L-1和3.80 mg·L-1。卢祥云等[30]对中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性研究结果显示，Hg2+的毒性大于Cu2+的毒性。根据已有研究[31-36]，这些差异性主要是由于蝌蚪所处发育阶段和暴露试验条件的不同所导致。

本文所测试的7种金属离子均对蝌蚪有一定的毒性，但中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪对同一离子的敏感性存在差异。Cu2+、Cr6+、Li+和Co6+对中华大蟾蜍蝌蚪的96 h-LC50分别是中国林蛙蝌蚪96 h-LC50的2.196、1.114、1.123、3.213倍，表明中国林蛙蝌蚪对上述4种金属离子的敏感性较中华大蟾蜍蝌蚪好。而Hg2+、Cd2+和Al3+对中国林蛙蝌蚪的96 h-LC50分别是对中华大蟾蜍蝌蚪96 h-LC50的1.354、2.836和1.231倍。有研究表明，Hg2+易于透过皮肤和鳃渗入动物体内，累积并对机体造成损伤[37]。而处于相同发育时期的中华大蟾蜍蝌蚪个体的肥满度高于中国林蛙蝌蚪的肥满度，提示其生理状况较好，代谢活跃，从而表现出对Hg2+具有相对较高的敏感性。根据Hg2+，Cd2+和Al3+的生理特性，可以认为中华大蟾蜍蝌蚪对Hg2+，Cd2+和Al3+的敏感性较中国林蛙蝌蚪的好是由不同物种形态、代谢、遗传特征的差异引起它们对污染物胁迫敏感性的不同。Cd2+进入机体后主要分布在肝脏，通过肝脏进行解毒代谢[37]，中国林蛙蝌蚪的肝指数较大,提示其解毒能力也就相对较强，这是中国林蛙蝌蚪对Cd2+耐受性较强的原因之一。此外，中国林蛙蝌蚪尾长全长比高于比中华大蟾蜍蝌蚪长的尾长全长比，提示二者的游动速度也有所差异，最终将表现出体内能量物质存储等方面的差异性，这些差异都是造成二者对同一金属离子敏感度不同的原因。当然，最终机制的确定需要进行生理代谢和遗传等方面的深入研究。

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Comparison Study on the Acute Toxicity of 7 Metal Ions on theRanachensinensisandBufogargarizansTadpoles

Ma Li, Wu Minyao, Wang Hongyuan*

Co-Innovation Center for Qinba regions’sustainable development，College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119, China

Received 13 November 2014 accepted 27 January 2015

The purpose of this paper is to evaluate the acute toxicity of Cu2+, Hg2+, Cr6+, Cd2+, Li+, Al3+and Co2+on the Rana chensinensis and Bufo gargarizans tadpoles at Gosner stage 36. The median lethal concentration (LC50) values at 7 kinds of metal ions to the R. chensinensis and B. gargarizans tadpoles were calculated, respectively. In addition, morphological characters (fatness, liver index) of R. chensinensis and B. gargarizans tadpoles were determined. The results showed that 96 h-LC50of Cu2+, Hg2+, Cr6+, Cd2+, Li1+, Al3+and Co2+for the R. chensinensis tadpoles were 0.270 mg·L-1, 0.803 mg·L-1, 2.375 mg·L-1, 7.351 mg·L-1, 11.273 mg·L-1, 17.265 mg·L-1and 20.973 mg·L-1, respectively. While the 96 h-LC50for the B. gargarizans tadpoles were 0.593 mg·L-1, 0.593 mg·L-1, 2.827 mg·L-1, 2.592 mg·L-1, 12.656 mg·L-1, 14.020 mg·L-1and 57.435 mg·L-1, respectively. The sensitivity of the R. chensinensis to Cu2+, Cr6+, Li+and Co6+were higher than those of B. gargarizans tadpoles. In contrast, the sensitivity of the B. gargarizans to Hg2+, Cd2+and Al3+were higher than those of R. chensinensis tadpoles. Different morphological characters of the R. chensinensis and B. gargarizans tadpoles are one of the factors for their different sensitivity to the same metal ions.

Rana chensinensis tadpoles; Bufo gargarizans tadpoles; metal ion; LC50

“秦巴山区可持续发展协同创新中心”资助

马丽(1988-)，女，硕士研究生，研究方向：发育生物学，E-mail: mali6212164@snnu.edu.cn

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: hongyuanwang@snnu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20141113002

2014-11-13 录用日期：2015-01-27

1673-5897(2015)3-230-08

X171.5

A

王宏元(1974-)，男，博士，讲师，主要从事发育生物学和生态毒理学方面的研究工作。

马丽，吴民耀，王宏元. 7种金属离子对中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性比较研究[J]. 生态毒理学报，2015, 10(3): 230-237

Ma L, Wu M Y, Wang H Y. Comparison study on the acute toxicity of 7 metal ions on the Rana chensinensis and Bufo gargarizans tadpoles [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 230-237 (in Chinese)