Cd2+对BY-2细胞的毒性机制及水杨酸的缓解作用

张明轩，李颖邦，刘爱云，张学文

湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128



Cd2+对BY-2细胞的毒性机制及水杨酸的缓解作用

张明轩，李颖邦，刘爱云，张学文*

湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128

镉对生态环境的危害表现出对植物这种定生生物的毒害性。以绿色荧光蛋白(GFP)膜泡标记的烟草BY-2细胞为实验材料，分别在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察了Cd2+对植物细胞的毒害作用和机制，并研究了水杨酸(SA)处理对Cd2+植物细胞毒害的缓解作用。研究发现激光共聚焦显微镜可以观察到Cd2+处理3 h后细胞荧光亮度减弱，6 h时细胞皱缩和液泡缩小，9 h细胞大多死亡。在Cd2+胁迫同时加入SA，可显著提高细胞成活时间，荧光亮度增强、液泡化程度加大，同时能够观察到荧光标记的细胞膜包裹Cd2+的高荧光颗粒。SA处理的细胞还通过高度液泡化来缓解重金属Cd2+的毒性。结果表明具有生物活性的SA诱导细胞的液泡化，并通过膜成分对重金属的包裹和结合进一步降低了重金属对植物细胞的毒害。因此水杨酸缓解重金属对植物细胞的毒性，是通过诱导细胞的液泡化和膜对重金属离子的包裹束缚而实现的。

镉；水杨酸；荧光标记BY-2细胞；联合作用

随着工农业的持续发展，工业污水和废渣继续排放，化肥的大量使用，造成我国土壤和水源的重金属污染加剧[1]。过量的重金属会对植物有毒害作用，并且通过食物链和生物富集作用，最终会危害到人体健康，带来一系列的社会问题[2-3]。重金属污染问题已经日益受到人们的重视，植物对重金属胁迫抵御机制的研究也在日益深入。重金属在植物体内会不断累积，当累积超过一定的阀值之后，会对植物细胞结构造成不可逆转的损伤，并最终影响到植株体的正常生理活动[4]。为应对重金属胁迫带来的损伤，植物进化出独特的防御机制，如通过提升一些保护酶的活性、激素含量水平的变化等措施来降低受到的伤害[5]。水杨酸(salicylic acid，SA)是一种酚类化合物，普遍存在于植物体内，其化学名称为邻羟基苯甲酸[6]。由于SA存在增强植物在热胁迫、盐害、低温、干旱、等非生物胁迫条件下清除活性氧的能力，降低细胞受到的氧化损伤[7]。SA被认为是研究植物抵御胁迫的信号分子，因此研究水杨酸对Cd2+胁迫下细胞的影响，可以从细胞水平上揭示水杨酸对植物细胞抗重金属胁迫的机制，对其应用于植物防御重金属毒性有着重要意义。结构是功能的基础，植物受重金属胁迫后，在其细胞结构上的改变是植物一系列生理活动异常的细胞学基础。为了开展这项研究，我们利用烟草膜泡运输特征蛋白SCAMP2[8]与绿色荧光蛋白GFP进行基因重组并转化植物模式细胞——烟草BY2细胞，获得了膜泡荧光标记的BY2细胞。烟草BY2细胞作为一种模式植悬浮培养细胞开展的研究，具有均一性好、条件容易控制、培养周期短、重复性好等优点[9]，而用其进行重金属盐毒性的研究，可以直接从细胞水平来研究重金属盐对细胞的作用，避开了植株水平根吸收及输运过程的影响。

1 材料和方法(Naterials and methods)

1.1 实验材料

SCAMP2-GFP膜泡荧光标记的BY-2细胞由湖南农业大学细胞生物学实验室提供。

1.2 实验方法

将离心收集的BY-2细胞悬浮于MS培养基A中；将等量的BY-2细胞悬浮于含有0.068 mmol·L-1CdCl2的MS培养基B中(预实验表明0.068 mmol·L-1为BY-2细胞在试验周期中的半致死浓度)；将等量的BY-2细胞悬浮于含有0.068 mmol·L-1CdCl2与0.1 mmol·L-1SA的MS培养基C中(如表1)。把处理A、B和C同时置于120 r·min-1、26 ℃中培养，在3 h、6 h、9 h分别取样进行细胞荧光观察(10×20)。以及分别取出培养6 h的样品进行激光共聚焦观察(Confocal laser scanning microscope FV1000)。用移液器吸取少许细胞，滴在载玻片上，再用去离子水稀释，利用移液器枪头将细胞充分打散，再加盖玻片后，显微镜下观察照相。

2 结果与分析(Results and anslysis)

细胞荧光观察实验结果表明：当BY-2细胞培养至3 h的时候，可以发现对照组A和Cd-SA处理组C中细胞超微机构无明显破坏，大多数细胞处于分裂前、中期；而Cd处理组B中少数细胞已经出现细胞核染色质凝集，核仁散开，核膜破裂，染色质从核孔散出，细胞皱缩和液泡缩小并出现导致细胞死亡的症状(图1)。当BY-2细胞培养到6 h的时候，处理A、C中细胞的超微结构依然没有明显破坏，大多数细胞仍然处于分裂前、中期；而处理B中多数细胞已经进入细胞坏死状态，其膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，最后细胞破裂(图2)。当BY-2细胞培养到9 h的时候，处理A中细胞超微结构仍然没有明显破坏，细胞生长状态良好；处理C中有个别细胞出现了细胞核染色质凝集，核仁散开等细胞死亡的症状，但仍然有不少处于正常分裂期的细胞；而处理B中极大多数细胞已经完全裂解，细胞开始分散，细胞间的黏附度下降，细胞呈现出不正常的生长状态，在显微镜下只能看到少量分散荧光或者已经看不到任何荧光(图3)。由图4可知，处理B细胞的存活率呈现出明显的下降趋势，在9 h处存活率最低，下降幅度是最大的；培养基C细胞存活率下降度比培养基B细胞要低，并且在9 h处理C细胞存活率明显要高于处理B细胞。

表1 细胞处理的配组

注：+为加入该物质处理，-为未加入该物质处理。

Note: + treatment; - without treatment.

图1 荧光标记BY-2培养3 h处理后细胞形态Fig. 1 The cell morphology of the GFP labeled BY-2 after 3 h treatment

图2 荧光标记BY-2培养6 h处理后细胞形态Fig. 2 The cell morphology of the GFP labeled BY-2 after 6 h treatment

细胞激光共聚焦实验结果表明：当BY-2细胞培养到6 h的时候对照A中细胞的超微结构无明显变化，质膜完整，细胞正常生长，形态良好；处理B中细胞出现和荧光显微镜观察下相同的情况：大部分细胞体积异常增大，细胞分散肿胀，细胞器变形或肿大，细胞质膜破碎，细胞呈现出坏死状态；处理C中大部分细胞超微结构无明显变化，细胞体积正常，生长状态良好，部分细胞高度液泡化，并且在细胞质膜上出现了明显的荧光亮点。

图3 荧光标记BY-2培养9 h处理后细胞形态Fig. 3 The cell morphology of the GFP labeled BY-2 after 9 h treatment

图4 荧光标记BY-2水杨酸和Cd2+处理时间与细胞存活率柱形图Fig. 4 The BY-2 survival chart after treatment of SA and Cd2+

3 讨论(Discussion)

利用烟草膜泡绿色荧光蛋白GFP标记的BY-2细胞，结合当细胞受到重金属Cd2+影响后在膜泡上荧光强度的大小，在单细胞或亚细胞水平上，研究外源SA在细胞水平与植物镉耐性的相关性，可以很明显的得出细胞荧光强度越强镉的耐受性越大。

图5 BY-2培养6 h后在激光共聚焦显微镜下观察到荧光集中点Fig. 5 The fluorescence enclose are observed around the BY-2 membrane after 6 h SA-Cd treatmen t of the cell under the CLSM

通过对图1、2、3分析发现，在重金属Cd2+处理3 h，与对照组A相比较，水杨酸存在时镉处理的Cd-SAC组中大部分细胞呈现出高度的液泡化，体积膨大明显，并且绝大部分的细胞荧光亮度达到了最大值；而Cd处理的B组中大部分细胞除了体积膨大外也已呈现出皱缩的现象。在重金属处理的6 h处，Cd-SA处理组大部分细胞仍保持体积膨大的状态，且少部分细胞荧光亮度没有减弱；而Cd处理的B组细胞则荧光亮度减弱，细胞皱缩现象加剧。在9 h处，Cd处理的B组细胞亮度降到了最低值，绝大部分细胞已皱缩死亡；Cd-SA处理的C组仍有部分细胞保持较大的体积和较强的荧光亮度。推测原因，细胞以高度液泡化的形式来抵御重金属带来的损伤。细胞通过高度液泡化来缓解重金属的毒害作用，这与李春烨等[10]的实验结果相一致，所以细胞体积膨大；另外，由于在外源SA的影响下，Cd-SA处理的C组细胞SCAMP2膜泡运输蛋白数量增加，加大了对重金属Cd2+的运输，大大提高了荧光亮度和降低了重金属的毒害作用，细胞死亡率有所降低。

通过图4发现，在重金属Cd2+胁迫6 h时，与对照组培养基A相比较，Cd-SA处理的C细胞呈现出更高程度的液泡化，并且只有Cd-SA处理的C组细胞膜上出现了高荧光颗粒(如图5中箭头方向所示)，与高电子密度颗粒一致，Liu和Kottkel[11]证实这些高电子密度颗粒中含有Cd2+。这说明细胞质中游离的Cd2+以细胞质膜包裹的形式进入细胞内，达到了减少胞外Cd2+的数量和降低对细胞带来的伤害。另外，由图4我们也可以发现，已有高荧光颗粒开始脱离细胞质膜进入细胞内部，说明在细胞质膜处形成了凹陷，Cd2+离子将会被膜泡包裹，然后脱离质膜，将重金属隔离在特定部位，以减少破坏作用[12,13]。宇克莉等[14]证明，细胞液泡内含有各种的蛋白质、糖类等物质，能够有效地与重金属结合，并且液泡膜上存在转运重金属的H-ATP酶和Ca-ATP酶，从而降低重金属的毒害作用。一般情况下，植物对于低浓度的重金属胁迫通过其细胞壁的固定作用、质膜的选择透过性和液泡的区室化作用可以产生一定的抵御能力。在重金属胁迫下，细胞内部会形成数量不等的囊泡，包裹有重金属的囊泡将会与液泡相融合，达到重金属解毒的效果[15-16]。

SA作为一种小分子酚类化合物，在植物受到生物或非生物胁迫时，其生物活性会被激活，在抵御生物和非生物胁迫带来的伤害。在受到重金属胁迫后，植物内源SA水平升高，抗氧化系统酶类活性升高，热激蛋白、PRP、RP、几丁质酶等蛋白等防御基因表达活性提高，植物对重金属胁迫的抵御能力提高[17]。通过施加外源SA有助于缓解重金属的毒害作用，提高对非生物胁迫的抗性[18-20]。李丰涛[21]在研究镉对红麻根尖细胞结构的影响中发现，在不同浓度的Cd胁迫处理下，红麻的根系活力明显降低，根膜透性也有一定的上升，Cd对红麻根系确实造成了损伤。另外还发现，在施加了外源的GSH且在较低浓度Cd胁迫时,细胞壁和细胞膜出现黑色沉积，Cd离子被阻隔在了原生质之外，保护了细胞。在本研究中同样也发现了类似的情况。在Cd2+处理后，BY-2细胞出现质壁分离和原生质膜破裂现象，并且细胞器出现逐渐减少的现象，核膜、核仁解体而游离在胞质中。在进行Cd-SA处理后，细胞质膜周围出现了包裹着重金属离子的高电子密度颗粒，且细胞的存活率也较高，说明在外源SA的影响下，BY-2细胞内的重金属Cd2+得到了有效的生物处理，减缓了这些超微结构的改变给细胞造成的不可逆的损伤。本研究得到的实验结果与李丰涛在研究中施加外源GSH来缓解Cd对红麻根尖细胞结构毒害作用的结果较为相似，为本研究中采用施加外源SA的研究方法提供了一定的知道思路。

本实验研究表明，在重金属Cd2+胁迫下，Cd-SA处理的细胞存活率较高，并由于其SCAMP2转运蛋白的高生物活性，获得了较高荧光亮度，并且在质膜处也发现了高电子密度颗粒，说明外源SA在协助细胞抵御重金属胁迫中是有一定的促进效果的。

致谢：感谢植物激素及生长发育湖南省重点实验室提供和协助进行扫描激光共聚焦观察。

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Cadmium Toxicology to Cultured BY-2 Cells and the Relief Effects of Salicylic Acid to the Cadmium Toxicity

Zhang Mingxuan, Li Yingbang, Liu Aiyun, Zhang Xuewen*

College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

Received 30 October 2014 accepted 27 November 2014

The toxicity to immobilized plants is one of the most harmful effects of heavy mental cadmium to the ecological environment. In this paper the toxicity and mechanism of Cd2+to plants cells were analyzed by fluorescence microscope and confocal laser scanning microscope observation in GFP membrane labeled BY-2 cell. The relief effects of salicylic acid (SA) treatment to the Cd2+toxicity were also investigated. The results showed that the GFP fluorescence of the labeled cells was getting dimming after 3 h Cd2+treatment. The cells and vacuoles were apparently shrunk after 6 h. All the cells were dead after 9 h treatment. When SA was also added during the Cd2+treatment, the survival time of the treated cells were prolonged significantly. The SA and Cd2+treated cells also showed stronger fluorescence and better vacuolization compared to the Cd2+treatment. High fluorescence particles attached to the cell membrane were observed, indicating that there were wrapped Cd2+microcapsules formed in SA treatment cells. The results suggest that the SA treatment can relieve the toxicity of heavy metals both by high vacuolization in the cells and by membrane components retention of the heavy metals ion. The conclusion is that the microcapsule retention and vacuolization of the cells induced by SA is the mechanism of the SA toxicity relief.

cadmium; salicylic acid; GFP membrane labeled BY-2 cell; combined effect

湖南省教育厅一般项目(12C0156)

张明轩 (1989-), 男, 硕士研究生, 研究方向为分子细胞生物学, E-mail: 18684851879@163.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: xwzhang@hunau.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20141030001

2014-10-30 录用日期：2014-11-27

1673-5897(2015)3-224-06

Q247

A

张学文(1965-)，男，植物学博士，教授，主要从事细胞生物学教学与研究，发表论文50余篇。

张明轩, 李颖邦, 刘爱云, 等. Cd2+对BY-2细胞的毒性机制及水杨酸的缓解作用[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(3): 224-229

Zhang M X, Li Y B, Liu A Y, et al. Cadmium toxicology to cultured BY-2 Cells and the relief effects of salicylic acid to the cadmium toxicity [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 224-229 (in Chinese)