吡草醚原药对大鼠一般生长情况的影响及其慢性肾毒性研究

万力, 宋世震, 樊柏林, 杨文祥, 刘春霞, 唐晓荞, 孙凡中, 刘瑶,*

1. 武汉科技大学医学院公共卫生学院，湖北 武汉 430065 2. 湖北省疾病预防控制中心，应用毒理湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079



吡草醚原药对大鼠一般生长情况的影响及其慢性肾毒性研究

万力1,2, 宋世震1, 樊柏林2, 杨文祥2, 刘春霞2, 唐晓荞2, 孙凡中2, 刘瑶2,*

1. 武汉科技大学医学院公共卫生学院，湖北 武汉 430065 2. 湖北省疾病预防控制中心，应用毒理湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079

研究吡草醚原药对大鼠一般生长情况的影响，寻找慢性毒性靶器官以及确定最大无作用剂量(NOAEL)。将初重为40～50 g的SPF级SD大鼠随机分成对照、低、中和高剂量组，160只/组，雌雄各半。各组动物分别给予含有不同浓度吡草醚原药的饲料(0，80，400，2 000 mg·kg-1的饲料)，染毒期间不限制摄食饮水，期限为104周。结果显示雌、雄鼠中、高剂量组1～104周的体重、增重、食物利用率与对照组比较，于不同阶段均有不同程度降低，差异有显著性(P <0.05或P <0.01或P<0.001)；中、高剂量受试物可导致大鼠血液中尿素氮(BUN)水平升高及胆碱酯酶(ChE)水平下降，肾脏器系数升高，与对照组比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01或P<0.001)；病理学检查显示中、高剂量组可引起肾小管上皮细胞变性、肾脏间质炎、慢性进行性肾病等。实验结果表明在本试验条件下，中、高剂量的吡草醚原药可明显影响大鼠的体重增长及食物利用率，对SD大鼠的慢性毒性靶器官是肾脏。

吡草醚；慢性毒性；靶器官

吡草醚是一种新颖的触杀型除草剂，主要用于麦田防除各种阔叶杂草，对禾谷类作物选择性高[1]，同时在经济类作物也有应用[2-3]。以水稻和棉花为代表性的这两类作物在我国的农业生产中占很大的比重。随着我国人口快速地增长，科学地增加作物产物早已成为农业工作者思考的问题，而新型的除草剂也早已投入农业生产中使用。

外源化学物本身可与环境或生物群的相互作用，最终可迁徙或富集于人群接触到的环境或食物链中[4]。用于农业生产的除草剂最终也会以各种代谢形式或剂量被人群接触[5]，有研究表明吡草醚在环境中污染小、易降解[6]，但目前国内外关于吡草醚啮齿类动物一般毒性研究资料尚少[7]。本研究小组已对吡草醚展开初步的毒理学研究，但随着吡草醚在农产业的广泛应用，促使我们需更进一步对其毒性进行探讨。慢性毒性试验作为毒理学安全性评价的最后也是最关键的一个阶段，也是新型农药登记必不可少的方面，可为外源化学物一般毒性评价提供较为全面的数据。

根据已有的亚慢性经口毒性试验结果：最小有害作用剂量(LOAEL)为125.00 mg·kg-1，最大无作用剂量(NOAEL)为31.25 mg·kg-1，本研究小组依据《GB 15670-1995 农药登记毒理学试验方法》[9]设计慢性毒性试验，本文主要从一般生理生化角度对吡草醚的慢性毒性进行分析，本组裴兰洁等从病理组织学角度对吡草醚的慢性毒性及致癌性进行了分析[8]，共同寻找慢性毒性靶器官及确定NOAEL，为建立该除草剂的安全接触限值提供依据。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 实验动物及饲养环境

选用SPF级SD大鼠，雌雄各320只，初重为40～50 g，由上海西普儿-必凯实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2008-0016，合格证号：No. 0066915。所有实验动物饲养于湖北省实验动物中心SPF级屏障系统内，饲喂该中心提供的经辐照灭菌的全价营养颗粒饲料。环境条件：温度23±3 ℃，湿度40%～70%，明暗交替12 h，噪音在60 dB以下；换气频率：10～18次/h。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 主要实验仪器

全自动生化分析仪(日立7020型)，尿液分析仪(优利特-100)，TC-120G组织自动脱水机(孝感泰维公司)，莱卡RM2235切片机(莱卡公司)，日本OLYMPUS显微镜。

1.2.2 主要试剂

血生化检测用试剂：上海丰汇医学科技有限公司，尿液常规检测用试纸条：桂林优利特医疗电子销售有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1动物分组及剂量设计 共设1个对照组和3个剂量组，所有大鼠随机分为160只/组，雌雄各半，各组动物所食饲料吡草醚原药含量分别为0，80，400，2000 mg·kg-1的饲料。

1.3.2 染毒途径及期限

各剂量组动物采用含定量受试物的饲料连续104周饲喂染毒，对照组动物饲喂含有相同营养成分的正常饲料，整个期间动物自由摄食饮水。

1.3.3 检测指标

1～13周每周称取所有动物体重、摄食量1次，14～104周每4周称取所有动物体重、摄食量1次；试验26、52、78周分别取计划解剖的动物(20只/组，雌雄各半，单性别检测数n=10)、104周取各组存活的全部动物(单性别检测数n>10)，采集血液做血生化检测，采集尿液进行尿常规检测，，大体解剖称量脏器计算脏器系数并进行组织病理学检查。

1.3.4 数据统计

计量资料如体重、进食量、血液生化、脏器重量等指标进行单因素方差分析(ANOVA)，用Dunnett检验比较各剂量组同对照组的差异显著性；动物的临床症状观察、动物死亡率等计数资料的统计采用X2检验；病理解剖所见、组织学所见采用Fisher确切概率检验；数据采用SPSS12.0软件分析(在以下各柱形图中，**，***分别表示：与对照组相比，P <0.01、P<0.001)。

2 结果(Result)

2.1 对大鼠体重(Body Weight, BW)及体重增重(Weight gain, WG)的影响

与对照组比较，低剂量组雌雄大鼠的各周BW和0～104周的阶段性WG均无统计学差异(P>0.05)；雌鼠中剂量组第2～32周的BW下降，36～104周的BW差异无显著性(P>0.05)，而0～26周的WG下降(P<0.01)；雌鼠高剂量组1～104周的BW均明显下降(P<0.01)，各阶段WG亦下降明显(P<0.01)。雄鼠中剂量组1～3周的BW差异有显著性(P<0.01)，其余各周BW及各阶段的WG差异亦无显著性；雄鼠高剂量组1～104周的BW及各阶段的WG均下降，差异有显著性(P<0.01或P<0.001)。吡草醚对大鼠体重及体重增重的影响，详情见图1～4：

2.2 对大鼠食物利用率的影响

与对照组比较，低剂量组雌、雄大鼠有个别周次的食物利用率存在差异，但1～26、1～52、1～78、1～104周的平均食物利用率均未见统计学差异(P>0.05)；中剂量组仅雌鼠部分周的食物利用率及1～26周的平均食物利用率与对照组比较降低，差异有显著性(P<0.05或P<0.01或P <0.001)；高剂量组雌、雄大鼠部分周的食物利用率及1～26、1～52、1～78周的平均食物利用率与对照组比较均降低，差异有显著性(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。各阶段平均食物利用率详情见表1：

图1 吡草醚原药对雌性大鼠体重的影响Fig. 1 Effects on body weight of female rats

图2 吡草醚原药对雌性大鼠体重增重的影响Fig. 2 Effects on body weight gain of female rats

图3 吡草醚原药对雄性大鼠体重的影响Fig. 3 Effects on body weight of male rats

图4 吡草醚原药对雄性大鼠体重增重的影响Fig. 4 Effects on body weight gain of male rats

表1 吡草醚原药对大鼠平均食物利用率的影响±s)

注：*，**，***分别表示与对照组比较P<0.05，P<0.01，P<0.001； (A)：Average。

Note: Compared with control group,*: P<0.05,**: P<0.01,***: P<0.001; (A)：Average food efficiency.

2.3 对尿液常规及血液生化的影响

各剂量组26、52、78、104周雌雄动物尿液常规检验与对照组比较差异均无显著性；与对照组比较，受试物各剂量组对大鼠血浆中谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、总胆红素(T-BIL)，在26、52、78、104周分别有不同程度的影响，但不具有确定的毒理学意义；与对照组比较，26周时，雄鼠高剂量组BUN升高(P<0.05)；78、104周时，雌鼠高剂量组BUN均升高(P<0.001)，104周雄鼠中、高剂量组BUN升高(P<0.05，P<0.001)；与对照组比较，仅低剂量组52、104周的雌鼠和78周雄鼠Crea下降(P<0.05)；与对照组比较，高剂量组雌鼠的26、78、104周的ChE均下降(P<0.05，P<0.001)。吡草醚原药对大鼠血液生化的影响，详情见表2：

2.4 对肾脏重量和脏器系数的影响及病理学检查

中剂量组雌鼠104周肾脏重量，脏器系数均升高，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)；中剂量组雄鼠26周肾脏器系数升高(P<0.01)。高剂量组雌鼠52、78、104周肾脏器系数均升高(P<0.01，P<0.001)；高剂量组雄鼠26、78周肾脏器系数均升高(P<0.05，P<0.01)；104周病理学检查显示中剂量组可引起雌鼠肾脏间质炎(见图5，彩插d)，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)，高剂量可引起雌鼠肾小管上皮细胞变性(见图5，彩插e)，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。吡草醚原药对大鼠肾脏器系数的影响，详情见表3：

表2 吡草醚原药对大鼠血液生化的影响±s)

注：*，**，***分别表示与对照组比较P<0.05，P<0.01，P<0.001。

Note: Compared with control group,*: P <0.05,**: P <0.01,***: P <0.001.

表3 吡草醚原药对大鼠肾脏重量及脏器系数的影响±s)

注：*，**，***分别表示与对照组比较P<0.05，P<0.01，P<0.001。

Note: Compared with control group,*: P <0.05,**: P <0.01,***: P <0.001.

a对照组 正常肾脏组织结构(H.E.×100) b低剂量组 肾小管内蛋白管型(H.E.×100)

a Control group normal kidney tissue structure b Low-dose group protein tubes type in kidnet tubules

c中剂量组 肾小管上皮细胞变性(H.E.×100) d中剂量组 肾脏间质炎性细胞浸润(H.E.×100)

c Middle-dose group renal tubular epithelial cells degeneration d Middle-dose group renal interstitial inflammatory cell infiltration

e高剂量组 肾小管上皮细胞变性(H.E.×100) f 高剂量组 肾脏间质炎性细胞浸润(H.E.×100)

e High-dose group Renal tubular epithelial cells degeneration f Middle-dose group renal interstitial inflammatory cell infiltration

图5 吡草醚原药慢性毒性试验104周大鼠肾脏病理学检查

Fig. 5 Pathologic observation on kidney of rats

3 讨论(Discussion)

我国是农药生产以及出口大国，早在2008年，化学农药累计产量为190万t，其中除草剂为61.6万t，占32.4%[10]。如此大的产量和使用量，需有规范的法律来约束。新型农药需要登记后使用是农业部门加强农药管理的有效控制手段之一。化学类除草剂多是长残留型，有文献报道目前生产中普遍使用的除草剂中有20%～70%会长期残留于土壤中，从而使土壤，地下水、粮食受到污染。动物食用除草剂污染的饲料，侵害其肝、肾、消化器官，人类食用受除草剂残留污染的食品，对健康造成严重影响，可以造成肿瘤、肾坏死等[11]。所以对新型除草剂慢性毒性的研究，既有利于农药的管理，也有利于预防该农药引起的疾病。

本试验对照组动物在整个试验周期内，处于GLP实验室的管理条件内，其体重、食物利用率等一般生理、生化检测指标均处于良好的质控范围以内[12]，可为其他慢性毒性研究的开展提供部分参考。低剂量组大鼠体重较对照组无明显变化，可推测在低剂量染毒水平下,吡草醚对两种性别大鼠增重均无明显影响，但高剂量组动物BW、WG明显下降，其中雌鼠增重降低较雄鼠更为明显；中剂量组动物染毒初期BW、WG降低，雌鼠分别于32周及0～26周以前有差异性，雄鼠仅1～3周BW有差异性，提示差异性雌鼠较雄鼠更为明显。两种性别中剂量组动物的体重增长均表现出染毒初始阶段有差异，后无明显变化这一特点。同时病理组织学研究亦发现吡草醚的慢性毒性表现出一定的雌雄差异[8]，这可能与生物体对外源化学物的敏感性和耐受性强弱有关，可推断雄鼠较雌鼠对吡草醚有较强的耐受性，这也是慢性毒性表现出一定雌雄差异的主要原因。与体重增长相关的食物利用率同样也表现出高剂量组动物明显降低以及中剂量组雌鼠染毒初始阶段的降低；提示高于中剂量染毒水平之下，两种性别的大鼠在摄入吡草醚后均产生了一定的生长抑制作用。血液中BUN和Crea水平是目前临床评价肾功能最常用的指标[13-14]。本次试验结果Crea的降低无明显剂量-反应关系，亦无明确的毒理学意义；根据26～104周各试验组共4阶段的检测结果，大鼠血液中BUN的升高呈现明显的剂量-反应关系，同时在时间上表现出明显的慢性进行性升高，提示吡草醚可引起大鼠肾功能慢性进行性改变。临床上的肝肾功能不全者通常表现出血液中ChE含量升高，本试验结果中的ChE下降尚无确实依据，其下降的原因和机制还有待进一步的试验论证。各剂量组肾脏重量无明显差异性，但由于大鼠体重的降低导致中、高剂量组肾脏器系数升高，并且满足剂量-反应关系，亦表现出时间上的慢性进行性升高这一特点。通过生理生化结果可初步了解吡草醚对大鼠的慢性毒性特征，但未能观察致癌性；本组裴兰洁等发现的病理组织学改变为肾小管上皮细胞变性、肾脏间质炎等，即共同证明：吡草醚的慢性毒性表现出一定的雌雄差异性，肾脏是其主要靶器官。

慢性毒性试验是毒理学安全性评价的最终同时也是最关键阶段之一，其目的是寻找因长期接触外源化学物后可能产生毒效应的器官，但外源化学物的毒效应器官可以是靶器官，也可以是其他器官[15]。通过本次试验结果可推断吡草醚原药对大鼠慢性毒性靶器官以及效应器官之一是肾脏。计算得出NOAEL为：雌、雄大鼠均为80 mg·Kg-1的饲料，根据1～104周大鼠体重、摄食量均值计算得出吡草醚原药每日摄入量NOAEL为：雌性大鼠为7.45 mg·kg-1·d-1，雄性大鼠为5.84 mg·kg-1·d-1，以上数据可为建立吡草醚安全接触限值提供依据。

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◆

Effect of Pyraflufen-ethyl on Growth and Kidney of Rat

Wan Li1,2, Song Shizhen1, Fan Bolin2, Yang Wenxiang, Liu Chunxia2, Tang Xiaoqiao2, Sun Fanzhong2, Liu Yao2,*

1. School of Public Health，Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430065, China 2. Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hubei Key Laboratory for Applied Toxicology, Wuhan 430079, China

Received 21 Februray 2014 accepted 12 May 2014

To investigate the general effect of pyraflufen-ethyl on rat growth, to discover potential target organs under chronic toxic challenge and determine NOAEL. SPF level SD rats, body weight between 40 to 50 grams, were randomly divided into control, low, middle and high dose groups, 160 rats/group, half male and half female. The rats were fed with forage containing different concentrations of pyraflufen-ethyl for 104 weeks, and had free access for drinking water. It was discovered that compared to the control group, there was significant decrease in body weight、weight gain and food efficiency at different stage in high dosage group (P<0.05); There was significant increase in blood BUN level, kidney weight rate, and decrease in ChE level in middle and high dose group (P<0.05). Histological examination showed degeneration of renal tubular epithelial cells, interstitial nephritis, chronic nephrosis in high dose group. These results demonstrated that middle to high dose of pyraflufen-ethyl inhibits weight gain and food efficiency in rat, and kidney is the target organ of chronic toxicity of the medicine.

pyraflufen-ethyl; chonic toxicity; target organ

万力(1987-)，男，硕士在读，研究方向：劳动卫生与环境卫生学，E-mail: wanli_cnwh@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: liuyao20021154@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20140221001

2014-02-21 录用日期：2014-05-12

1673-5897(2015)3-093-08

X171.5

A

刘瑶(1974-)，女，医学硕士，副主任医师，主要从事健康相关类产品毒理学研究。

万力, 宋世震, 樊柏林, 等. 吡草醚原药对大鼠一般生长情况的影响及其慢性肾毒性研究[J]. 生态毒理学报，2015, 10(3): 93-100Wan L, Song S Z, Fan B L, et al. Effect of pyraflufen-ethyl on growth and kidney of rat [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 93-100 (in Chinese)