内质网应激在罗哌卡因诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

冯亮群

(河南省洛阳市妇女儿童医疗保健中心麻醉科，河南 洛阳 471000)

内质网应激在罗哌卡因诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

冯亮群

(河南省洛阳市妇女儿童医疗保健中心麻醉科，河南 洛阳 471000)

目的 探讨内质网应激在罗哌卡因诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用。方法 罗哌卡因组采用3 mmol／L罗哌卡因处理SH-SY5Y细胞，阻断组采用10 mol／L SB203580及3 mmol／L罗哌卡因处理SH-SY5Y细胞。分析各组细胞增殖活性、凋亡，活性氧簇（ROS）及p38MAPK水平。结果 与对照组比较，细胞存活率罗哌卡因组显著降低（t=5.29，P＜0.05），阻断组较罗哌卡因组显著升高，但显著低于对照组（t=3.18，t=4.96，P＜0.05）；罗哌卡因组细胞凋亡率较对照组及阻断组显著升高（F=125.16，P＜0.05）；罗哌卡因组细胞内的ROS水平显著升高（P＜0.05），阻断组ROS水平较对照组高（P＜0.05）但显著低于罗哌卡因组（P＜0.05）；各组p38MAPK水平差异无统计学意义（P＞0.05），罗哌卡因组p-p38MAPK显著升高，阻断后表达水平降低（P＜0.05）。结论 罗哌卡因处理SH-SY5Y细胞能诱发细胞内ROS的蓄积，抑制细胞增殖活性，促进凋亡，p38MAPK通路的激活在诱导凋亡的过程中有重要作用。

活性氧簇；罗哌卡因；SH-SY5Y；细胞凋亡

随着局部麻醉药（简称局麻药）在椎管内麻醉的广泛应用，其安全性及可能存在的神经毒性越来越引起学者的关注[1]。局麻药的神经毒性主要表现以神经纤维或脊髓初级神经元的损伤为主，包括暂时性神经病学综合征（transient neurological syndrome，TNS）[2]及马尾神经综合征（cauda equine syndrome，CES）[3]。局麻药用于椎管内或区域神经阻滞，可直接作用于神经元，破坏其氧化磷酸化，干扰线粒体跨膜电位[4]，促进神经元程序性死亡。多项研究表明，罗哌卡因能触发神经元细胞内活性氧簇（ROS）暴发，在神经毒性机制中有重要的作用[5]。笔者分析了p38MAPK途径在罗哌卡因诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用，为预防临床罗哌卡因引起的神经毒性及开发有效的治疗药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM／F12培养基、FBS（Gibco公司）；盐酸罗哌卡因（AstraZeneca公司）；细胞凋亡试剂盒、噻唑蓝(MTT)、p38MAPK、p-p38MAPK及 GAPDH抗体（Abcam公司）；SH-SY5Y细胞株（中科院上海生命科学研究院细胞资源中心）。

1.2 方法

细胞培养复苏：置SH-SY5Y细胞株于含有15%FBS、青霉素100 U／mL、链霉素100 μg／mL的DMED／F12培养基，于37℃及5%CO2培养箱中培养2 d，细胞贴壁后分组处理细胞。将SH-SY5Y细胞随机分为3组，即对照组（无血清培养基培养30 h），罗哌卡因组（3 mmol／L罗哌卡因＜国药准字H20050325，广东华润顺峰药业有限公司＞），无血清培养基培养30 h）及阻断组（3 mmol／L罗哌卡因+10 μmol／L SB203580，无血清培养基培养30 h）。

细胞内ROS检测：将各组细胞培养液用胰酶消化细胞后，按1∶1 000用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释荧光探针DCFH-DA，按终浓度10 μL／L加入DCFH-DA于培养液中，37℃培养箱中孵育20 min，用 PBS洗去多余未进入细胞的DCFH-DA，制成单细胞悬液。以激发光波长488 nm、发射波长524 nm、FCM检测各组细胞内荧光强度。

MTT法检测细胞存活率：收集各组细胞，调节细胞悬液浓度至1×106／mL。每孔加入MTT溶液10 μL，继续培养4 h。1 000 r／min离心10 min，弃上清液，每孔加入DMSO 100 μL，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD570（630 nm校准）测量各孔的 OD值。增殖抑制率=（1-OD试验组／OD对照组）× 100%。

流式细胞术测定细胞凋亡情况：收集细胞，用100 μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min。500～1 000 r／min离心5 min，沉淀细胞，孵育，缓冲液洗1次。加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不时振动。流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长为560 nm的滤器检测PI。

Western bolt法分析细胞p38MAPK等蛋白表达水平：加200 μL裂解液（50 mmol／L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol／L PMSF，0.1% NP-40，蛋白酶抑制剂），4℃12 000 r／min离心15 min，取上清液，采用Bradford法检测蛋白浓度。取上述制备的蛋白样品50 μg，上样到15%SDS-PAGE凝胶，电泳完毕后将蛋白电转至NC膜，用5%脱脂奶粉封闭，分别加一抗，37℃孵育2 h，经0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000），室温孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X线胶片定影，扫描后用IPP 6.0进行图像分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用

MTT检测显示，与对照组比较，罗哌卡因组细胞存活率显著降低（t=5.29，P＜0.05），阻断组细胞存活率较罗哌卡因组显著升高，但显著低于对照组（t=3.18，t=4.96，P＜0.05），见图1。

图1 MTT检测各组细胞增殖活性

2.2 对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

采用流式细胞术Annecxin-FITC／PI双染检测各组SH-SY5Y细胞凋亡率，结果显示，罗哌卡因组细胞凋亡率为(37.15± 7.02)%，较对照组的(5.16±1.25)%及阻断组的(14.91±5.11)%显著升高（F=125.16，P＜0.05）。

2.3 对SH-SY5Y细胞ROS及p-p38MAPK的影响

与对照组比较，罗哌卡因组细胞内的ROS水平显著升高（P＜0.05），阻断组升高（P＜0.05）但显著低于罗哌卡因组（P＜0.05），见图 2。p38-MAPK在各组间差异无统计学意义（P＞0.05），但在罗哌卡因组，p-p38MAPK显著升高，阻断后表达水平降低（P＜0.05），见图3。

图2 各组细胞内ROS水平

图3 Western blot法分析各组p38MAPK表达水平

3 讨论

罗哌卡因的结构特征和药理特性与布比卡因类似，但心血管和中枢神经系统毒性均较布比卡因低[6]，广泛应用于蛛网膜下腔阻滞麻醉，具有低浓度时感觉-运动神经分离现象突出的优点[7]。相同浓度、剂量的罗哌卡因和布比卡因用于蛛网膜下腔阻滞时，运动神经阻滞起效时间罗哌卡因慢且弱[8]。罗哌卡因能可逆地减少神经纤维膜对钠离子的通透性，减慢去极化的速度，提高应激阈值，优先阻滞感觉纤维，使运动神经纤维轻微阻滞。但由于罗哌卡因与血浆蛋白结合率低，脂溶性差，对神经膜、神经鞘膜及血脑屏障的穿透弱、蓄积能力差[9]。

过氧化物、DNA损伤及钙离子自稳态等因素均能诱导神经细胞凋亡，神经细胞在进入 DNA降解前，线粒体功能发生紊乱，内膜跨膜电位消失，激活凋亡相关代谢改变[10]。ROS暴发是导致神经细胞急性损伤的主要因素之一，其在细胞内累积，破坏细胞内氧化还原的动态平衡，损伤线粒体膜，还可与核酸、蛋白直接发生作用使其功能发生抑制。研究显示，p38MAPK途径在神经细胞凋亡中有重要作用[11]。本研究中采用罗哌卡因处理SH-SY5Y细胞，结果显示，细胞内的ROS水平显著升高，细胞的增殖活性降低，凋亡率升高；经p38MAPK阻断剂SB203580阻断后，细胞的增殖活性及凋亡率均较罗哌卡因处理组显著改善。由图3可知，各组间p38MAPK的表达无显著性差异，但磷酸化的p38MAPK的表达差异显著，p-p38MAPK是其活化形式，其表达升高提示p38MAPK通路的激活。神经细胞损伤时存在ROS的蓄积[12]，如羟自由基、超氧阴离子等造成神经组织氧化应激状态[13]，参与神经损伤的发生发展。ROS作为第二信使，激活包括MAPK在内的信号转导通路，使丝氨酸／苏氨酸激酶信号级联活化，造成神经细胞损伤。

综上所述，罗哌卡因处理SH-SY5Y细胞能诱发细胞内ROS的蓄积，抑制细胞增殖活性，促进凋亡，且p38MAPK通路的激活在诱导凋亡的过程中有重要的作用。

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The Role of Endoplasmic Reticulum Stress in Ropivacaine Inducing SH-SY5Y Cell Apoptosis

Feng Liangqun
(Anesthesiology Department,Luoyang Women and Children Health Care Center,Luoyang,Henan,China 471000)

Objective To analyse the role of endoplasmic reticulum stress in ropivacaine inducing SH-SY5Y cell apoptosis.M ethods The ropivacaine group was given 3 mmol／L ropivacaine to treat SH-SY5Y cells，the blocking group was given 10 μmol／L SB203580 and 3 mmol／L ropivacaine.Cell proliferation，apoptosis，ROS and p38MAPK levels were analyzed.Results Compared with the control group，the cell survival rate of the ropivacaine group after treatment was significantly reduced(t=5.29，P＜0.05)，the cell survival rate of the blocking group was significantly higher than the ropivacaine group，but significantly lower than the control group(t=3.18，t=4.96，P＜0.05);apoptosis rate in the ropivacaine group was higher than the control group and the blocking group(F=125.16，P＜0.05); The ROS levels in ropivacaine group were significantly increased(P＜0.05)，ROS levels in blocking group was higher than the control group(P＜0.05)，but significantly lower than the ropivacaine group(P＜0.05);the difference of p38MAPK in each group has no statistical significance(P＞0.05)，but p-p38MAPK was significantly higher in the ropivacaine group and the level of which in the blocking group deceased(P＜0.05).Conclusions Ropivacaine in treating SH-SY5Y cells can induce intracellular ROS accumulation, inhibit cell proliferation，induce apoptosis，and plays an important role in activating p38MAPK pathway.

ROS;ropivacaine;SH-SY5Y;cell apoptosis

R965；R971+.2

A

1006-4931(2015)17-0013-03

冯亮群（1968-），女，大学本科，副主任医师，主要从事临床麻醉工作，（电子信箱）flq_681122＠163.com。

2015-03-13)