细胞毒性筛选在新药研发中的风险分析

刘亚辉，陈玉文

(沈阳药科大学工商管理学院，辽宁 沈阳 110016)

细胞毒性筛选在新药研发中的风险分析

刘亚辉，陈玉文

(沈阳药科大学工商管理学院，辽宁 沈阳 110016)

目的 分析细胞毒性筛选在新药研发中存在的风险因素。方法 引入风险管理理念，对细胞毒性筛选相关文献进行检索和梳理，提出细胞毒性筛选中存在的风险。结果 细胞模型选择存在3个风险因素；评价指标确定存在1个风险因素；单指标检测技术存在7个风险因素，因技术不同风险侧重点也不同；多指标检测技术两种技术各存在2个风险因素。结论 对新药研发细胞毒性筛选每一环节的风险进行有效控制，并在此基础上通过联合检测建立体外分层系统毒性筛选平台，是降低新药研发因毒性而研发失败风险的关键。

细胞毒性；风险管理；评价指标

新药研发是一项投资大、风险高、周期长的工程，据统计，上市一种新药需10～15年，耗资3.5亿～5亿美元[1]，而毒性已成为新药研发失败的主要原因，占 40% ～44%[2]。2005年至2008年，国家药品审评中心统计的19个不批准品种的原因中，非临床试验结果不支持临床试验的仅占30%[3]，可见早期毒性筛选在新药研发中很重要。新药研发阶段细胞毒性筛选的筛选率低、灵敏度不高，如何保证其准确率已成为当前药物安全性评价工作亟待解决的重大问题。笔者拟从细胞模型的选择、评价指标的确定及检测技术的遴选过程3个方面识别细胞毒性筛选的风险因素，为建立可控风险内的体外分层系统的毒性筛选平台提供依据。

1 细胞模型选择风险

细胞毒性筛选常用的细胞主要来自人体组织或与人体亲缘关系较近的生物体，根据受试物的不同会有不同的选择。

细胞存在种属差异性的风险：细胞毒性筛选中来自非人体组织的细胞存在种属差异性，有可能导致待测化合物的细胞毒性无法真实地表现出来。有学者利用大鼠、小鼠、人和恒河猴的肝细胞评估肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导正常细胞凋亡的敏感性，结果显示，TRAIL可诱导人正常肝细胞的凋亡，而其他几个物种动物的肝细胞却没有出现凋亡特征，表明肝细胞对TRAIL的敏感性存在种间差异，若将TRAIL用于人类癌症治疗，可能会出现肝毒性[4]。

细胞单一类型无法全面反映机体整体毒作用的风险：单一类型的细胞只能评价对机体某一器官的毒性，而不能反映出对机体的整体毒作用，甚至不能反映待测化合物的毒性机制。虽然胚胎干细胞可以克服采用单一类型终末分化细胞不能全面评价待测化合物对组织器官毒性的缺陷，但目前存在分化细胞高可变性、异常基因组型、分化操作方法标准化等问题[5-6]。

细胞不健康、难以培养等自身风险：待测化合物的细胞毒性是通过与细胞作用观察细胞状态来反映的。细胞毒性筛选需要大量的细胞株，并且还要进行平行、多批次处理，因此细胞自身的健康情况、稳定状况以及培养的难易程度都可能会影响实验结果。

2 评价指标确定风险

评价指标是基于细胞数量、形态、生理特征和结构评价细胞毒性变化特征的指标[4]。目前此类指标不超过20个，且大部分与生长增殖、代谢功能及膜的完整性有关[7]。选择的评价指标能否客观、灵敏地反映待测化合物的细胞毒性，直接决定着筛选的成败。以选择细胞膜的完整性作为评价指标为例，有些待测化合物并不会引起细胞膜破损，但实际上确实引起了细胞坏死。

3 检测技术风险

3.1 单指标

根据不同的评价指标，可以建立不同的检测技术。按照评价指标可将检测技术分为细胞生长抑制／增殖、膜完整性和细胞代谢活性3类。以细胞生长抑制／增殖为评价指标的技术是四氮唑盐（MTT）比色法、黄酰罗丹明B法和集落形成试验；以膜的完整性为评价指标的技术有乳酸脱氢酶释放法、台盼蓝染色法、荧光染色法和中性红摄取法；以细胞代谢活性为评价指标的技术阿尔玛蓝显色法、三磷酸腺苷(ATP)生物荧光技术和同位素掺入法。通过对近10年文献进行整理和总结，单指标检测技术存在的风险因素有7个，每种技术存在的风险同中有异，详见表1。

细胞接种量过多或太少的风险：细胞接种量是影响实验结果的重要因素。细胞过少，生成的反应物会偏低；导致灵敏度降低。细胞过多，饱和后细胞继续增殖会导致氧和营养被大量消耗，乳酸、氨等有毒代谢产物大量积累，导致细胞凋亡，干扰待测化合物筛选结果的准确性[8]。

培养基的成分／种类干扰的风险：培养基的血清浓度和酚红等有影响试验孔吸光度值的可能，胎牛血清可使乳酸脱氢酶（LDH）的释放量增加，使MTT比色法出现难溶的蛋白沉淀。

表1 检索文献中反映细胞毒性筛选单指标的检测技术风险因素统计

反应条件选择不恰当的风险：反应条件如时间、温度、pH、测定波长等参数的确定及各类试剂的选择，是保证实验顺利进行的关键。细胞吸光度值与检测波长间具有较大的相关性，使用不同的检测波长细胞的吸光度值也会发生很大的变化。用来提取活细胞摄入的中性红染料是否能够提取完全，对结果同样有很大的影响。

操作过程丢失细胞的风险：检测技术中涉及到的清洗细胞或上清步骤，操作繁杂，操作不当很容易导致细胞或反应产物丢失，从而影响结果的测定[9]。

待测化合物与染料反应的风险：MTT比色法中，有研究发现，过氧化物会抑制将近95%的MTT与O2-反应。还有研究证实，多酚类化合物可直接与MTT反应，即使没有细胞存在，MTT吸光值也随之增高。

染料对细胞具有毒性的风险：检测技术中染料的性质很重要。染料一旦对细胞具有毒性，这种毒性就会被误认为是待测化合物对细胞的毒性，导致待测化合物毒性被高估。

结果判断客观性差的风险：集落形成试验是通过显微镜计数来确定集落数量，计算烦琐，主观性强[10]。台盼蓝染色法细胞计数为纯手工操作，易受主观因素的影响。

3.2 多指标

3.2.1 流式细胞仪

流式细胞仪检测快速、灵敏，对操作人员的专业要求高，影响其准确度的风险有2个。

制备单细胞悬液损伤细胞的风险：在制备单细胞悬液的过程中，悬液细胞很容易聚集成团，在采取方法分散细胞时很容易瞬间或持久地影响细胞的性质，如显而易见的细胞膜破损、难以察觉的线粒体活性变化等。这种对细胞原有特性的破坏，直接影响了细胞毒性筛选的准确度。

操作不当丢失细胞的风险：使用流式细胞仪分析细胞内成分时，需要进行荧光染色、细胞固定和反复冲洗的步骤。冲洗过程操作不当很容易丢失细胞，影响细胞毒性筛选的准确度。

3.2.2 高内涵成像分析技术

高内涵成像分析技术目前尚处于发展阶段，还有大量需要解决的技术难题，其中筛选试剂和匹配软件开发是最突出的问题。

荧光染料相互干扰的风险：高内涵成像分析技术中采用的多种荧光染料共同沾染细胞，但染料会相互干扰导致其灵敏度下降[11]。而目前荧光染料的整合应用并未得到长足发展。

匹配软件开发不足的风险：高内涵成像分析技术是以影像为基础的筛选技术，在筛选过程中会产生大量数据，但目前高内涵成像分析技术还无法处理大量数据，也不具备比例成像分析和对细胞内所有荧光物质的分析能力，软件开发不足直接影响了高内涵成像分析技术的灵敏度和效率。

4 结语

细胞模型选择、评价指标确定和检测技术遴选是细胞毒性筛选重要的环节，对每一环节的风险进行有效的风险管理，并在此基础上通过联合检测建立体外分层系统毒性筛选平台，是降低新药因毒性而研发失败或退市的风险的关键。

[1]吴 慧，彭 英，孙建国，等.体外代谢在新药早期评价中的应用与发展[J].药学学报，2013，48（7）：1 071-1 079.

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[3]马 .早期毒性优化筛选在药物候选决策中的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2013，27（1）：419.

[4]刘 涛，郭 辰.毒理学研究中的体外细胞毒性评价[J].生命科学，2014，26（3）：319-324.

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[9]罗奇志，林 琳，王芙艳，等.MTT方法的优化[J].激光生物学报，2014，23（3）：279-282.

[10]牛红军，李邦东，孙 昊，等.抗肿瘤药物体外筛选技术研究进展[J].生命科学仪器，2014，12（2）：29-33.

[11]胡晶阳，严春琳，朱 彦，等.高内涵筛选应用于中药现代化的前景展望[J].天津中医药大学学报，2013，32（2）：120-124.

The Risk Research of Cytotoxicity Screening in Research and Development of New Drugs

Liu Yahui，Chen Yuwen
(School of Business Administration，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang，Liaoning,China 110016)

Objective To analyse the risk factors in the research and development of new drugs of cytotoxic screening.Methods The risk management in cytotoxicity screening was introduced，the literature was searched and sorted to bring out the risk in cytotoxicity screening.Results Cell models had three risk factors;the evaluation index had one risk factors;the single index detection techniques had seven risk factors.Conlusion It is the key to reduce the R＆D failures due to toxicity through effective controlling of the risk in every aspect of cytotoxic screening in R＆D；on this basis，establish the tiered system in vitro toxicity screening platform by joint detection.

cytotoxicity；risk management；evaluation index

R965.1

A

1006-4931(2015)17-0001-02

刘亚辉，男，硕士研究生，研究方向为新药研发风险控制，（电子信箱）847087905＠qq.com；陈玉文，男，教授，博士研究生导师，研究方向为新药研发风险，本文通讯作者，（电子信箱）cywwyc＠163.com。

2015-03-30)

科技部“十二五”重大新药创制国家科技重大专项“辽宁省国家重大新药创制综合平台——基于信息管理的新药研发风险控制技术”，项目编号：2013ZX09301305。