绿原酸对心肌缺血-再灌注损伤的防护作用基础研究

张 骏，杨小利，王红勇

（中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科·重庆市心血管病研究所，重庆 400042）

绿原酸对心肌缺血-再灌注损伤的防护作用基础研究

张 骏，杨小利，王红勇

（中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科·重庆市心血管病研究所，重庆 400042）

目的 观察绿原酸对SD大鼠心肌缺血-再灌注损伤的防护作用并分析其作用机制。方法 选取清洁级健康雄性SD大鼠16只（200～220 g）。随机分为缺血-再灌注组（I／R组）和绿原酸干预组（CGA+I／R组），每组8只。适应性饲养1周后，CGA+I／R组给予灌胃绿原酸 50 mg／kg，I／R组给予同样方法灌等量生理盐水，连续饲养2周后建立在体心脏缺血-再灌注损伤模型，各组均缺血30 min，再灌注24 h后收集标本，心脏标本留取进行氯化三苯基四氮唑法（TTC）染色观察心肌梗死面积，酶联免疫吸附试验(ELSIA)法检测大鼠血清中乳酸脱氢酶（LDH）含量。同时，应用H9C2细胞建立缺氧复氧损伤模型（缺氧8 h，复氧24 h），随机分为3组，即对照组、缺氧复氧组（A／R组）和绿原酸干预组（CGA+A／R组）。复氧结束后，收集上清液及细胞，上清液利用ELISA法检测炎症因子白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子- （TNF- ），应用qRT-PCR检测收集细胞的IL-6及TNF- mRNA含量，96孔板中细胞应用CCK-8检测细胞活力。结果 与I／R组比较，CGA+I／R组能显著减少心肌梗死面积[（23.97±2.8)%比(16.2±2.1)%，P＜0.05）]，抑制心肌酶释放[（5 038±257.6)U／L比(4 005±206.8)U／L，P＜0.05）]；与 A／R组比较，CGA+A／R组能显著减少细胞的损伤[（51.6±7.8)%比(69.7±6.6)%，P＜0.05）]，抑制炎症因子的释放（P＜0.05）。结论 绿原酸可通过抑制炎症因子的释放从而发挥对心肌缺血-再灌注损伤的防护作用。

绿原酸；心脏保护；缺血-再灌注损伤；炎症因子

缺血性心脏病具有高致残率和高死亡率的特点[1]，缺血-再灌注损伤是影响其预后的重要因素之一，如何预防已成为临床研究热点。缺血-再灌注损伤的机制复杂，其中炎症反应是始动因素，也贯穿整个过程。既往研究证实，若能抑制炎症反应的发生，即可显著改善缺血-再灌注损伤[2]。绿原酸广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中[3]，具有强烈的抗炎、抗氧化、调节免疫等作用[4]，对大小鼠的脑缺血-再灌注损伤具有防护作用[5]。因此，笔者拟用绿原酸对心脏缺血-再灌注损伤进行防护，并对其机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

绿原酸（成都曼思特生物科技有限公司，批号为 MUST-13031401）；2.5%戊巴比妥钠、氯化三苯基四氮唑（TTC），均购自美国sigma公司。乳酸脱氢酶（LDH）以及白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。H9C2细胞株，由大坪医院心血管内科实验室提供。

1.2 试验方法

动物与分组：12周清洁级健康雄性 SD大鼠 16只，体重200～220 g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供，动物合格证编号为41003100000258。SD大鼠随机分为2组，即缺血-再灌注组（I／R组）和绿原酸干预组（CGA+I／R组，50 mg／kg），每组8只。适应性饲养1周后，CGA+I／R组给予灌胃50 mg／kg，I／R组同样方法灌等量生理盐水，连续2周。

缺血-再灌注损伤模型建立：以绿原酸及生理盐水灌胃完成的SD大鼠，建立在体心脏缺血再灌注损伤模型。2.5%戊巴比妥钠（50 mg／kg）腹腔注射麻醉，呼吸机辅助呼吸，备皮消毒，于左侧胸腔第4，5肋间横向剪开皮肤及第1层及2层肌肉，钝性分离第3层肌肉，开胸器暴露心脏，分开心包膜，于左心耳下2～3 mm结扎（活结）前降支，关闭胸腔，30 min后打开胸腔，剪开结扎线，重新关闭胸腔，缝合皮肤，24 h后收集心脏标本及血液标本。

心肌细胞缺氧复氧损伤模型建立：利用H9C2细胞建立心肌细胞缺氧复氧损伤模型。H9C2细胞分别接种于96孔板和6孔板中，分为对照组（control组）、缺氧复氧组（A／R组），绿原酸组（CGA+A／R组）、A／R组与CGA+A／R组于接种24 h后在缺氧罐内进行缺氧8 h，复氧24 h后收集上清及细胞标本，CCK-8检测96孔板内细胞活性。

1.3 检测指标

TTC法检测心肌梗死面积：配制1%TTC液体，将心脏标本从-80℃冰箱中取出，沿心尖到心底部平行切成 2 mm大小 5～7片，放入1%TTC液体中37℃水浴箱中温孵15～20 min，存活心肌将染成红色，梗死心肌为灰白色。染色完毕后，放入4%的多聚甲醛中固定48 h后照相，图片用Image J软件对心肌梗死面积进行统计。

ELISA法测定LDH，IL-6，TNF-α含量：检测血清中的LDH含量以及细胞上清液中的LDH，IL-6，TNF-α含量，检测步骤按照ELISA测定试剂盒说明进行。

QT-PCR法检测表达水平：应用Trizol法提取H9C2细胞总RNA，测定RNA浓度，然后进行逆转录。TNF-α，上游5’-CACCACGCTCTTCTGTCTACTGAAC3’，下游 5’CCGGACTCCGTGATGTCTAAGTACT3’； IL-6， 上 游 5’ CTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTG3’，下游 5’TGGTCTGTTGTGGGTGGTATCC3’；β-actin作为内参，上游5’ACTATCGGCAATGAGCGGTTCC3’，下游5’CTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG3’。qRT-PCR检测反应系统依据TaKaRa公司RNA Kit（AMV）Ver 3.0说明步骤进行。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 对心肌梗死面积的影响

在经历缺血30 min再灌注24 h后，利用TTC染色方法检测心肌梗死面积。与I／R组比较，CGA+I／R组心肌梗死面积明显减少[（23.97±2.8)% 比(16.2±2.1)%），P＜0.05]，见图1。

图1 各组心肌梗死面积统计分析

2.2 心肌酶谱释放

通过ELISA方法检测大鼠血清中LDH的含量发现，与I／R组比较，CGA+I／R组心肌酶释放明显减少[（5 038±257.6)U／L 比(4 005±206.8)U／L，P＜0.05]，见图2。

图2 各组血清LDH含量比较

2.3 心肌细胞缺氧复氧后细胞死亡

通过CCK-8检测心肌细胞存活情况，发现CGA+A／R组心肌细胞活性明显升高，且与 A／R组比较显著提高[（51.6± 7.8)%比(69.7±6.6%），P＜0.05]，见图3。

图3 各组细胞活性比较

2.4 心肌细胞缺氧复氧后炎症因子释放结果见表1。

表1 各组IL-6及TNF- 含量比较（±s，n=5）

表1 各组IL-6及TNF- 含量比较（±s，n=5）

注：与Control组比较， P＜0.05；与A／R组比较，＃P＜0.05。

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2.5 绿原酸对TNF- 及IL-6 mRNA表达水平影响比较结果见图4。

图4 各组TNF- 和IL-6 mRNA的表达水平

3 讨论

缺血性心脏病是指各种原因引起的冠状动脉阻塞，从而导致心肌急性或长期缺血缺氧的疾病。缺血-再灌注损伤发生于缺血性心脏患者经药物或手术治疗后，对预后有着极大的影响。且近年来，心脏缺血-再灌注损伤的治疗在心血管系统研究领域一直处于热点状态，已建立诸多方法，如干细胞移植[6]、清除自由基[7]，但其安全性受到质疑，急需寻找新的治疗方案。

植物提取物治疗效果逐渐被大家认识并受到关注。绿原酸是奎尼酸与反式肉桂酸缩合而成的酯类化合物家族，是植物有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类次生代谢产物，广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，金银花、苹果、杜仲、绿茶、小麦、向日葵等植物中含量较高[3]。目前已有研究发现，绿原酸具有广泛的生物活性，如清除氧自由基、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等[8]，其中抗炎和抗氧化活性是绿原酸最重要的生物活性。研究发现，绿原酸能通过抑制炎症因子的释放减少脂多糖(LPS)诱导的肺损伤[9-10]。此外，绿原酸能显著减少脑缺血-再灌注造成的损伤，主要是通过抑制脑缺血后 TNF-α，IL-1β以及 IL-6等细胞因子的释放，减少炎症反应，减轻对血脑屏障的破坏[5]。本研究结果发现，绿原酸可显著减少心肌梗死面积、抑制心肌酶的释放；发现绿原酸还可显著减少缺氧复氧造成的 H9C2细胞的损伤，并通过ELISA和 QT-PCR方法检测炎症因子水平，发现绿原酸可抑制炎症因子的释放。

综上所述，绿原酸可通过抑制炎症因子的释放而发挥对心脏缺血-再灌注损伤的保护作用，且绿原酸来源于高等植物，并在日常饮食中含量高，故安全性高，具有一定实用价值。但本研究仅从基因及生化水平进行检测，未能从蛋白组学进行研究，存在一定局限性，尚待进一步研究。

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[4]刘 颖，郭明晔，白根本 .绿原酸的研究进展[J].中药材，2012，35（7）：1 180-1 185.

[5]李瑞奇，苗明三.绿原酸对大、小鼠脑缺血再灌注模型的干预作用研究[J].河南中医药学报，2014，12（6）：1 219-1 226.

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[7]刘永利，刘 斌.左西孟旦对H2O2所致大鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用[J].吉林大学学报，2014，19（3）：1 038-1 044.

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Protective Effect of Chlorogenic Acid against Myocardial Ischemia／Reperfusion Injury

Zhang Jun，Yang Xiaoli，Wang Hongyong
（Department of Cardiology，Chongqing Institute of Cardiovascular Diseases，Institute of Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing，China 400042）

Objective To investigate the cardioprotective effects of chlorogenic acid against myocardial ischemia／reperfusion injury and to analyze its mechanism.Methods 16 healthy SD rats of clean grade（200～220 g）were selected and randomly devided into two groups：ischemia reperfusion group （I／R group）and chlorogenic acid （CGA+I／R）group，8 rats in each group.After one week′s adaptive feeding，rats in the CGA+I／R group were gavaged with 50 mg／kg CGA，while rats in the I／R group were gavaged with equivalent normal saline for 2 weeks.In vivo cardiac ischemia／reperfusion injury model were then built in each rat.All heart samples were collected after 30 mins′ischemia and 24 hours′reperfusion，and dyed with triphenyltetrazolium chloride（TTC）to observe the infarction area of myocardium.LDH content was also measured in rats serum by ELISA method.H9C2 cells were used to build anoxia／reoxygenation（A／R）injury model（8 hours′anoxia and 24 hours′reoxygenation）.Cells were randomly devided into 3 groups：the control group，A／R group and CGA+A／R group.Superate and cells were respectively collected after reoxygenation.Supernate was used to detect inflammatory factors like IL-6 and TNF-α by ELISA method，cells were used to quantify mRNA of IL-6 and TNF-α by qRTPCR.96-well plates cells were used to test cell viability by using CCK-8 method.Results Compared with the I／R group，the CGA+I／R group had significantly less infarction area[（23.97±2.8)% vs.(16.2±2.1)%，P＜0.05），less myocardial enzyme release[（5 038±257.6)U／L vs.(4 005±206.8)U／L，P＜0.05）]；when compared with the A／R group，the CGA+A／R group could remarkably reduce cell injury [（51.6±7.8)% vs.(69.7±6.6)%，P＜0.05）]，and inhibit the release of inflammatory factors. Conclusion CGA plays an protective effects on myocardial I／R injury via inhibiting the release of inflammatory factors.

chlorogenic acid；cardioprotective；ischemia reperfusion injury；inflammatory factor

张骏(1982-)，男，大学本科，主治医师，主要研究方向为冠心病的发病机制及防治，(电话)023-68757800(电子信箱)zhangjun mj＠163.com；王红勇(1965-)，男，博士研究生，主任医师，教授，主要研究方向为动脉粥样硬化的基础与临床，本文通讯作者，(电话)023-68757214（电子信箱）whysir＠aliyun.com。

2015-03-17)

重庆市自然科学基金重点项目，项目编号：CSTC2011jjB10020。

R285.5；R282.71

A

1006-4931(2015)17-0003-03