PSMA6基因rs17458312位点多态性与脑梗死的相关性研究

赵西耀，何芳梅

PSMA6基因rs17458312位点多态性与脑梗死的相关性研究

赵西耀1，何芳梅2

[摘要]目的探讨中国汉族人群中PSMA6基因rs17458312(-1520C/T)位点的多态性与脑梗死的相关性。方法对211例脑梗死患者(病例组)和201例健康体检者(对照组)，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)检测PSMA6基因rs17458312位点单核苷酸多态性，并分析其基因型及等位基因频数的分布。结果CC、CT、TT基因型频率及C等位基因频率在两组中分布无显著性差异(P>0.05)。性别分层后，各亚组各基因型及等位基因频率分布也无显著性差异(P>0.05)。结论PSMA6基因rs17458312位点可能与脑梗死的发病无关。

[关键词]PSMA6基因；单核苷酸多态性；脑梗死

[本文著录格式]赵西耀，何芳梅. PSMA6基因rs17458312位点多态性与脑梗死的相关性研究[J].中国康复理论与实践, 2015, 21(9): 1091-1094.

CITED AS: Zhao XY, He FM. Association of rs17458312 polymorphism of PSMA6 gene with cerebral infarction [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1091-1094.

研究显示，泛素蛋白酶体系(ubiquitin-proteasome system, UPS)参与动脉粥样硬化全过程的调节[1]，UPS的基因多态性可能增加动脉粥样硬化及其并发症，如脑梗死的风险。蛋白酶体α6亚单位(proteasome subunit α type 6, PSMA6)是该体系的一个重要成分，已有许多研究发现PSMA6基因-8C/G位点(rs1048990)与冠心病、心肌梗死、糖尿病、颈动脉内中膜厚度、脑卒中等相关[2-5]。对于该基因的其他位点，目前研究很少。本文在中国汉族人群中对该基因的启动子rs17458312位点进行调查，分析其基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性及可能的作用机制。

1　对象与方法

1.1对象

病例组为2012年1月～2015年4月在西安医学院第一附属医院神经内科住院的动脉粥样硬化性脑梗死患者，病程≤1周，均为汉族，共211例。其中男性120例，女性91例；年龄37～82岁，平均(67.6±7.2)岁。所有患者均经临床及CT和/或MRI确诊(依照第四届全国脑血管病学术会议诊断标准)，排除心脏源性脑栓塞(房颤、心瓣膜病、心肌梗死、二尖瓣脱垂、心脏黏液瘤)、腔隙性脑梗死、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等其他原因引起的脑梗死。

对照组为同期该院健康体检者，均为汉族，共201名。其中男性112名，女89名；年龄36～80岁，平均(66.4±9.0)岁；均无脑卒中史，并经临床检查和/或影像学检查排除脑卒中。

两组间性别、平均年龄均无显著性差异(P> 0.05)。见表1。

表1　两组一般资料比较

所有标本的收集均经本人或其家属同意，并经西安医学院医学研究伦理委员会同意。

1.2方法

取清晨空腹静脉血5 ml，3.8%柠檬酸钠抗凝，碘化钾法提取外周血白细胞的基因组DNA，-20℃冰箱中保存备用。

根据PSMA6基因rs17458312位点(DNA序列号NC_000014.9)及其两侧DNA序列，在NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)设计限制性内切酶，该位点合适的限制性内切酶为MspI。

应用引物设计软件Primer Premier 5.0进行PCR引物序列设计，评分≥80分，包含实验研究的酶切位点并利于酶切结果分析的引物，并参考通用教材《医学分子生物学实验技术》中引物设计原则。引物由上海生工公司合成，

上游：5′-TAAATG GGAGTG TGC CTT GG-3′；

下游：5′-CAG GAGATC CAG GTT GCAGT-3′。

PCR反应体系共15.0 μl，包括10×Buffer 1.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.3 μl，50 pmol/μl上下游引物各0.2 μl，基因组DNA 0.5 μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.1 μl，MgCl 21.2 μl，dH2O 11.0 μl。

PCR反应条件：95℃热变性5 min，95℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃40 s。40个循环后于72℃延伸6 min，终止反应。

取PCR扩增产物10.0 μl、MspI酶0.1 μl、dH2O 3.4 μl及10×Buffer R 1.5 μl，使总体系为15.0 μl。37℃酶切7 h。然后进行琼脂糖凝胶电泳，150 V电泳0.5 h，观察结果。

1.3统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行分析。性别比例差异采用χ2检验，两组间平均年龄以(xˉ±s)表示，采用t检验。基因型和等位基因频率采用基因计数法计算、Hardy-Weinburg平衡吻合度检测，基因型和等位基因组间差异采用χ2检验。

2　结果

含有PSMA6基因rs17458312位点的PCR产物长191 bp，经MspI酶消化后产生两个片段，分别长132 bp和59 bp。杂合子CT基因型有3个片段，分别长191 bp、132 bp和59 bp；纯合子TT基因型只有1个片断，长191 bp；纯合子CC基因型有2个片断，长132 bp和59 bp。

病例组、对照组PSMA6基因rs17458312位点的基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡(P>0.05)，表明该多态性位点的基因型分布在所研究的人群中达到遗传平衡，具有群体代表性。见表2。

CC、CT、TT基因型及C等位基因频率在两组中分布均无显著性差异(P>0.05)。见表3。

性别分层后，男性及女性基因型及基因频率在两组间分布也均无显著性差异(P>0.05)。见表4、表5。

表2　 Hardy-Weinburg平衡吻合度检验

表3　两组基因型及等位基因频率比较

表4　两组男性基因型及等位基因频率比较

表5　两组女性基因型及等位基因频率比较

3　讨论

UPS是体内代谢调节的重要因素。许多研究显示，UPS通过多种途径参与动脉粥样硬化的调控。首先，核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)可以调节参与动脉粥样硬化的细胞因子和黏附分子的表达，降解炎症基因的阻滞子IκB蛋白[1,6]。UPS可增加NF-kB活性。其次，增强的氧化应激是动脉粥样硬化重要的病理生理事件，UPS通过核因子e2 p45相关因子2(nuclear factor erythroid 2 p45 related factor 2, Nrf2)在内皮细胞的氧化应激调节方面发挥着重要作用。再次，泡沫细胞是动脉粥样硬化的重要成分，通过促凋亡分子，UPS可以明显促进泡沫细胞形成；这些细胞的退化也需要一个有功能的UPS。最后，UPS还参与动脉粥样硬化发展中细胞死亡的分子调控[7]。

临床研究也提示泛素在动脉粥样硬化发生、发展中起重要作用。Herrmann等通过对25例心肌梗死患者进行验尸，通过免疫组化和半定量分阶段测量等方法，发现急性心梗患者动脉粥样硬化斑块中，泛素水平更高；在冠状动脉新生内膜区，发现泛素与平滑肌细胞肌动蛋白共存[1,8-9]。在动物模型中，发现药物阻滞泛素蛋白酶通路后，通过激活NF-κB，可以明显的减弱脑梗死和动脉粥样硬化的发生[2,10]。

真核细胞内的26S蛋白酶体是UPS的重要成分，其核心是一个20S的催化颗粒，后者由α环和β环组成。人类的PSMA6基因编码蛋白酶体α环的α6亚单位。因为UPS与动脉粥样硬化密切相关，因此推测PSMA6基因的改变将影响动脉粥样硬化的发生、发展。

事实上，许多研究显示，PSMA6基因与动脉粥样硬化、高血压、2型糖尿病、心肌梗死相关[2,11-12]，有理由相信它也与缺血性卒中相关[13]。

Freilinger等对601例德国缺血性脑卒中患者和736名对照者进行研究，对脑卒中患者进行TOAST分型，运用MALDI-TOF质谱法进行基因分型，发现PSMA6基因−8C/G位点与缺血性脑卒中整体和大动脉粥样硬化性卒中均呈相关性，GG基因型具有保护作用[14]。Savchuk等对102例乌克兰缺血性脑卒中患者和92名对照者，运用实时PCR方法进行PSMA6基因−8C/G位点的基因型分型，发现PSMA6基因−8G/G突变体与复发性缺血性卒中相关[15]。Heckman等对于713例患有脑梗死的白种人和166例非裔美国人进行研究，在20个先前报道与心肌梗死及冠心病相关的SNPs中，运用多元Logistic回归分析模型进行分析，发现PSMA6基因−8C/G位点与缺血性卒中相关，在所研究的白种人和非裔美国人中均起保护性作用[3]。Alsmadi等在1071例沙特阿拉伯冠心病患者和929名健康人中，通过分子信标为基础的基因分型分析的方法，对包括KIAA0391和PSMA6在内的染色体区域14q13.2的5个SNPs位点进行分析，发现2个单倍体型1A-2G-3C-4A-5A增加冠心病及心肌梗死的风险[16]。

对于rs17458312位点，目前未见相关研究。本研究发现，CC、CT、TT基因型及C等位基因频率分布在患者及健康人中均无显著性差异；性别分层后，各亚组各基因型及等位基因频率也均无显著性差异。故该位点可能与中国汉族人群脑梗死的发病无关。

目前的研究样本量不够大，同时存在抽样误差，群体代表性不完全，且可能存在遗传、种族、环境因素等作用，该基因型是否与脑梗死发病相关，还需通过加大样本量，包含多中心、不同种族的研究等多种方式，进一步明确，以为预防及治疗脑梗死提供分子遗传机制。

[参考文献]

[1] Gomes AV. Genetics of proteasome diseases [J]. Scientifica (Cairo), 2013, 2013: 637629.

[2] Ozaki K, Tanaka T. Molecular genetics of coronary artery disease [J]. J Hum Genet, 2015. [Epub ahead of print].

[3] Heckman MG, Soto-Ortolaza AI, Diehl NN, et al. Genetic variants associated with myocardial infarction in the PSMA6 gene and Chr9p21 are also associated with ischemic stroke [J]. Eur J Neurol, 2013, 20(2): 300-308.

[4] Liu J, Yuan XJ, Liu JX, et al. Validation of the association between PSMA6 -8C/G polymorphism and type 2 diabetes mellitus in Chinese Dongxiang and Han populations [J]. Diabetes Res Clin Pract, 2012, 98(2): 295-301.

[5] Wang H, Jiang M, Zhu H, et al. Quantitative assessment of the influence of PSMA6 variant (rs17458312) on coronary artery disease risk [J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(2): 1035-1041.

[6] Weber C, Zernecke A, Libby P. The multifaceted contributions of leukocyte subsets to atherosclerosis: lessons from mouse models [J]. Nat Rev, 2008, 8(10): 802-815.

[7] Herrmann J, Lerman LO, Lerman A. On to the road to degradation: atherosclerosis and the proteasome [J]. Cardiovasc Res, 2010, 85(2): 291-302.

[8] Herrmann J, Edwards WD, Holmes DR Jr, et al. Increased ubiquitin immunoreactivity in unstable atherosclerotic plaques associated with acute coronary syndromes [J]. J Am Coll Cardiol, 2002, 40(11): 1919-1927.

[9] Meiners S, Laule M, Rother W, et al. Ubiquitin-proteasome pathway as a new target for the prevention of restenosis [J]. Circulation, 2002, 105(4): 483-489.

[10] Elliott PJ, Zollner TM, Boehncke WH. Proteasome inhibition: a new anti-inflammatory strategy [J]. J Mol Med (Berl), 2003, 81(4): 235-245.

[11] Ozaki K. Genetic background of acute coronary syndrome [J]. Nihon Rinsho, 2010, 68(4): 615-620.

[12] Sjakste T, Paramonova N, Wu LS. PSMA6 (rs2277460, rs1048990), PSMC6 (rs2295826, rs2295827) and PSMA3 (rs2348071) genetic diversity in Latvians, Lithuanians and Taiwanese [J]. Meta Gene, 2014, 2: 283-298.

[13] Musunuru K, Kathiresan S. Genetics of coronary heart disease [J].Annu Rev Genomics Hum Genet, 2010, 11: 91-108.

[14] Freilinger T, Bevan S, Ripke S, et al. Genetic variation in the lymphotoxin-alpha pathway and the risk of ischemic stroke in European populations [J]. Stroke, 2009, 40(3): 970-972.

[15] Savchuk OI, Mel'nyk VS, Honcharov SV, et al. Frequency of allele polymorphism of immune proteasome catalytic subunits in patients with ischemic stroke [J]. Fiziol Zh, 2014, 60(1): 49-55.

[16] Alsmadi O, Muiya P, Khalak H, et al. Haplotypes encompassing the KIAA0391 and PSMA6 gene cluster confer a genetic link for myocardial infarction and coronary artery disease [J]. Ann Hum Genet, 2009, 73(Pt 5): 475-483.

作者单位：1.浙江大学医学院附属第二医院建德分院神经内科，浙江建德市311600；2.西安医学院第一附属医院神经内科，陕西西安市710077。作者简介：赵西耀(1980-)，男，汉族，河南开封市人，硕士，主治医师，主要研究方向：神经疾病的遗传学。通讯作者：何芳梅(1982-)，女，汉族，甘肃天水市人，硕士，主治医师，主要研究方向：神经疾病的遗传学。E-mail: morning820305@163.com。

Association of rs17458312 Polymorphism of PSMA6 Gene with Cerebral Infarction

ZHAO Xi-yao1, HE Fang-mei2
1. Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital (Jiande Branch), School of Medicine, Zhejiang University, Jiande, Zhejiang 311600, China; 2. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University, Xi'an, Shaanxi 710077, China

Abstract:Objective To evaluate the association between rs17458312 (-1520C/T) polymorphism of PSMA6 gene and cerebral infarction in Chinese Han population. Methods 211 cerebral infarction patients (case group) and 201 healthy controls (control group) were selected in the study. The single nucleotide polymorphism of rs17458312 of PSMA6 gene was identified with the polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). The genotypes and allele frequencies distributed in cerebral infarction patients and healthy controls were analyzed. Results The frequencies of CC, CT, TT genotypes and the C allele all revealed no significant difference between the case group and the control group (P>0.05). After stratified by genders, the difference among all genetypes and alleles weren't significant between subgroup (P>0.05). Conclusion The rs17458312 of PSMA6 gene might not be associated with the cerebral infarction.

Key words:PSMA6 gene; single nucleotide polymorphism; cerebral infarction

(收稿日期：2015-04-10修回日期：2015-07-13)

基金项目：陕西省教育厅专项科研计划项目(No.2010JK803)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.023

[中图分类号]R743.3

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2015)09-1091-04