核苷酸切除修复基因XPF无义突变与胃癌发生的相关性研究

魏中华　黄　琴　高　军　金艳凤　刘　敏

作者单位：201306 上海市第六人民医院病理科



核苷酸切除修复基因XPF无义突变与胃癌发生的相关性研究

魏中华黄琴高军金艳凤刘敏

作者单位：201306 上海市第六人民医院病理科

【摘要】目的探讨胃癌组织及胃癌细胞系中XPF C2169A无义突变与其发生的关系。方法对488例肿瘤患者外周血及64例胃癌组织进行基因组DNA的提取，应用Taqman MGB探针进行基因分型；应用免疫组化法检测XPF蛋白的情况。结果488例肿瘤患者外周血中C2169A无一发生突变，然而64例胃癌组织中发现32例(50%)发生突变，并导致XPF蛋白表达水平降低，羧基端失去194个氨基酸；XPF C2169A突变仅出现在癌组织中，而癌旁正常组织中没有突变；突变后表达的截断蛋白tXPF不能与ERCC1相互作用，迅速通过泛素化降解。结论胃癌中XPF C2169A主要是单等位基因突变，表明XPF是一个单倍型剂量不足修复基因，XPF C2169A突变可以作为胃癌早期诊断和治疗的靶点。

【关键词】核苷酸切除修复酶；单核苷酸多态性；突变；胃癌；泛素

(ThePracticalJournalofCancer，2015，30:0028～0031)

研究表明核苷酸切除修复酶(XPF)与肿瘤之间存在密切的联系，如XPF功能缺陷罹患皮肤癌的风险增加[1]，然而XPF与胃癌发生之间的关系仍有待进一步的阐述。本研究运用免疫组化分析胃癌与癌旁组织XPF蛋白的表达差异，TaqMan MGB探针结合激光捕获显微切割对血样及胃癌与癌旁组织进行基因分型，结合分子生物学实验综合分析XPF无义突变与胃癌发生的相关性。

1材料与方法

1.1资料

胃癌组织及血样分别为上海交通大学附属第六人民医院病理科和检验科2012年1月至2012年12月收集的样本。

1.2XPF基因单核苷酸多态性的选择及试剂

首先对XPF基因在NCBI SNP数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi showRare=on&chooseRs=all&go=Go&locusId=2072)进行生物信息学分析，再结合PFS数据库(http：//pfs.nus.edu.sg/(S(z33avc3onc224ksdhkac4m5h))/FuncDetail_V1.aspx?Func=NCBI_Gene_LinkOut&FuncAddInfo=2072)预测，选取rs2020959C>A(NM_005236.2：c2169C>A)作为研究对象。血样基因组DNA提取试剂盒及石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(DP330)购自北京天根生物技术有限公司；激光捕获显微切割组织DNA提取试剂盒(KIT0103)购自美国应用生物系统公司；TaqMan MGB探针和引物(C_11189219_10)用于rs2020959基因分型。15%的样本进行基因分型重复实验，100%结果一致。

1.3细胞培养

胃癌细胞系AGS、SGC7901和MKN45以及人胚肾细胞系HEK293T均购自中科院上海细胞库。10%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.4表达载体的构建

将XPF和ERCC1基因PCR扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接到pCDNA3.1载体上分别形成pCDNA-XPF和pCDNA-ERCC1表达载体；另外构建含有GFP标签的pEGFP-XPF载体。用全氏金突变试剂盒构建突变载体pEGFP-tXPF。所有载体在大肠杆菌TOP10中进行扩增，然后经过质粒纯化试剂盒抽提质粒，-20℃储存备用。

1.5免疫组织化学染色

所有标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续4 μm切片，常规HE染色。按照S-P免疫组化染色试剂盒说明书步骤进行XPF染色。以已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，以兔血清封闭液和同种属非免疫血清作为空白对照。阳性判断采用半定量标准：按染色强度及阳性染色细胞百分率计分，最后以上述2项评分之和作为评判标准，0~1分为低表达，≥2分为高表达。

1.6瞬时转染和western blot

HEK293T细胞以每孔1×105个细胞种植六孔板，转染前培育16 h；用转染试剂X-TREME GENE HP DNA(Roche Molecular Systems)转染24 h、48 h、72 h后，用细胞裂解液冰上裂解细胞20 min，收取蛋白进行定量。等量的蛋白经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上，5%牛奶封闭1 h，XPF单抗(Gene Tex)封闭过夜，PBS充分洗涤后用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，用增强化学发光系统进行检测。

1.7统计学分析

应用SPSS 16.0 统计软件进行分析处理，胃癌与癌旁组织间XPF表达的差异采用卡方检验，等位基因的分型应用Fisher确切概率。

2结果

2.1胃癌及血样中XPF C2169A突变的检测结果

488例肿瘤患者中无1例XPF C2169A发生突变，表明人群中该位点SNP并不常见，然而在64例胃癌中发现有32例发生杂合性突变(表1)，提示胃癌中这是一种体细胞突变。进一步对5例胃癌及癌旁组织分析发现，癌旁组织中XPF基因没有突变，然而有2例癌组织中共发生了突变，同样的突变出现在3例胃癌细胞系(AGS，MKN45，and SGC7901)中。XPF无义突变引入了一个非成熟终止密码，因此三株胃癌细胞表达截断和全长的XPF蛋白，与仅表达全长XPF蛋白HEK293T细胞相比，三株胃癌细胞中XPF蛋白表达明显降低(图1)。因此，C>A突变不是一个简单的SNP，而是与胃癌相关的无义突变。

表1　胃癌和肿瘤患者外周血中基因分型结果(例，%)

A为四株细胞系中XPF蛋白表达，B为应用Image J软件以β-actin为参照对上图XPF的定量分析。

2.2胃癌及癌旁组织中XPF蛋白的表达情况

113例癌旁组织中XPF呈高表达，24例癌组织中XPF呈高表达，表明胃癌组织中XPF表达的不稳定性。

2.3tXPF与ERCC1相互作用

XPF通过其羧基端的265个氨基酸与ERCC1相互作用(AA559-AA823)。通过免疫沉淀及免疫印迹检测tXPF或XPF与ERCC1的相互作用，结果表明与XPF相比，tXPF与ERCC1的相互作用明显降低(图2A)。为了进一步评价tXPF蛋白的稳定性，tXPF或XPF与ERCC1载体共转染AGS细胞1天、2天和3天。western blot结果表明XPF蛋白转染3天中依然稳定，tXPF蛋白转染后第3天稳定性明显下降(图2B和2C)。故推测XPF蛋白的稳定性有赖于其整体结构的完整性，而羧基端194个氨基酸的缺失则破坏了这种结构的完整性。为了验证这一点，将pCDNA3.1-HAtXPF载体转染AGS细胞，24 h后给予MG132(1种蛋白酶抑制剂)，3天后收取蛋白行western blot分析，在MG132处理后tXPF浓度显著升高，提示tXPF是通过泛素化途径降解的。进一步于AGS细胞中共同转染带有GFP标签表达tXPF或XPF蛋白与带HA标签的泛素载体，然后通过GFP抗体检测XPF或tXPF蛋白表达或通过HA抗体检测XPF或tXPF蛋白的泛素化。结果表明GFP抗体免疫沉淀后XPF或tXPF在MG132处理后都被泛素化，tXPF比XPF泛素化更明显，提示tXPF更易受到蛋白酶体的降解。

3讨论

胃癌是国内第三常见的恶性肿瘤[2]。尽管其病因还不是很清楚，但是遗传改变在胃癌的发生中有着很重要的作用[3]。本研究结果表明XPF基因2169位点的无义突变能够促进该修复蛋白的降解，而且该突变仅出现在胃癌组织中，而肿瘤病人的外周血和癌旁正常组织中没有突变，这些结果提示该突变是胃癌组织的特异性突变，可以作为一个阳性的生物学标记。核苷酸切除修复是DNA修复的重要途径之一[4]，切除修复过程中XPF与ERCC1形成异源性二聚体，因此干扰该二聚体形成的因素都会阻碍核苷酸切除修复[5]。我们研究发现XPF蛋白羧基端部分缺失会干扰XPF/ERCC1二聚体的形成，而且截断的XPF蛋白不稳定而逐渐降解。

根据流行病资料库记载，XPF基因2169位点A碱基突变率在墨西哥和日本人群中分别是4.1%和1.2%，然而在欧洲和中国人群中没有发现该位点突变(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2020959)。与此一致的是我们在488例汉族人群血样中没有发现该位点突变，相反在胃癌中发现有50%的突变，表明该位点的突变与胃癌的发生密切相关。一般认为肿瘤是一个复杂的疾病，散发性遗传变异通常不足以增加致癌风险，很有可能是DNA修复能力的破坏导致突变的积累，从而进一步加速了恶性的转化[6-7]。

A为体外XPF或tXPF与ERCC1相互作用，B和C为XPF和tXPF蛋白稳定性的比较，C为应用Image J 软件对B图XPF蛋白进行定量。

图2tXPF/ERCC1相互作用及tXPF蛋白的稳定性

虽然胃癌发生的确切机制还不是很清楚，但是来源于肿瘤研究的证据表明DNA修复酶XPF/ERCC1和胃癌之间是有相关性的。Matoka等应用组织重建模式研究了前列腺癌中核苷酸切除修复酶XPF/ERCC1的潜在作用，他们研究发现XPF/ERCC1有助于防止前列腺癌的产生，然而该修复途径的破坏会使前列腺上皮更易于向恶性转化[8]。另外Facista等研究发现结肠癌中XPF/ERCC1表达也是降低的[9]。

早期东方人群的研究显示ERCC1 3个多态性与胃癌的发生相关，研究表明XPF rs2276466C>G，rs6498486A>C多态性与胃癌之间没有联系[10]。但是Meta分析表明XPF单核苷酸多态性和胃癌之间存在联系[11]。本研究证明XPF rs2020959C>A 在胃癌组织中引入一个终止密码，提示在胃癌早期转化过程中XPF作为癌基因起作用。由于rs2020959C>A干扰了XPF的重要功能，我们把它作为一个突变而不是单核苷酸多态性。该突变主要是单等位基因，表明XPF是一个单倍型剂量不足修复基因。据我们所知，本研究首次报道XPF C2169A与胃癌发生的风险增加有关，对于正常细胞恶性转化可能具有关键性的作用。当肿瘤中表达截断蛋白tXPF时试图恢复DNA的正常修复功能值得更深入的研究。

参考文献

[1]Gregg SQ，Robinson AR，Niedernhofer LJ.Niedernhofer，Physiological consequences of defects in ERCC1-XPF DNA repair endonuclease〔J〕.DNA Repair (Amst)，2011，10(7)：781-791.

[2]Hu Z，Ajani JA，Wei Q.Molecular epidemiology of gastric cancer：current status and future prospects〔J〕.Gastrointest Cancer Res，2007，1(1)：12-19.

[3]Abnet CC，Freedman ND，Hu N，et al.A shared susceptibility locus in PLCE1 at 10q23 for gastric adenocarcinoma and esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Nat Genet，2010，42(9)： 764-767.

[4]Friedberg EC.How nucleotide excision repair protects against cancer〔J〕.Nat Rev Cancer，2001，1(1)：22-33.

[5]Kirschner K，Melton DW.Multiple roles of the ERCC1-XPF endonuclease in DNA repair and resistance to anticancer drugs〔J〕.Anticancer Res，2010，30(9)：3223-3232.

[6]Knudson AG.Two genetic hits (more or less) to cancer〔J〕.Nat Rev Cancer，2001.1(2):157-162.

[7]López-Lázaro M.A new view of carcinogenesis and an alternative approach to cancer therapy〔J〕.Mol Med，2010，16(3-4)：144-153.

[8]Matoka DJ，Yao V，Harya DS，et al.Deficiency of DNA repair nuclease ERCC1-XPF promotes prostate cancer progression in a tissue recombination model〔J〕.Prostate，2012，72(11)：1214-1222.

[9]Facista A，Nguyen H，Lewis C，et al.Deficient expression of DNA repair enzymes in early progression to sporadic colon cancer〔J〕.Genome Integr，2012，3(1)：3.

[10]He J，Xu Y，Qiu LX，et al.Polymorphisms in ERCC1 and -

XPF genes and risk of gastric cancer in an eastern Chinese population〔J〕.PLoS One，2012，7(11)：e49308.

[11]Vineis P，Manuguerra M，Kavvoura FK，et al.A field synopsis on low-penetrance variants in DNA repair genes and cancer susceptibility〔J〕.J Natl Cancer Inst，2009，101(1)：24-36.

(编辑：吴小红)

Correlation Study of Nonsense Mutation of Xeroderma Pigmentosum Complementation Group F (XPF) Gene and Gastric Carcinogenesis

WEIZhonghua，HUANGQin，GAOJun，etal.DepartmentofPathology，SixthPeople’sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai，201306

【Abstract】ObjectiveTo study the relation between C2169A nonsense mutation in XPF and Carcinogenesis in gastric cancer tissues and cell lines.MethodsGenomic DNA was extracted from blood samples of 488 cancer patients and 64 gastric tumors.The genotype was mapped using a Taqman MGB probe.Expression of XPF was examined by immunohistochemistry.ResultsThe C2169A mutation was not detected in 488 samples of blood genomic DNA，yet was found in 32 of 64 gastric cancer tissue samples (50.0%)，resulted in a 194 C-terminal amino acid loss in XPF protein and lower expression.The XPF C2169A was found in cancer tissues，but not in surrounding normal tissues.The truncated form of XPF (tXPF) impaired interaction with ERCC1，was rapidly degraded via ubiquitination.ConclusionIn gastric cancer，the C2169A mutation is monoallelic，indicating that XPF is a haplo-insufficient DNA repair gene.The C2169A mutation might be regarded as a therapeutic target for early diagnosis and treatment of gastric cancer.

【Key words】Nucleotide excision repair enzymes；Single nucleotide polymorphism(SNP)；Mutation；Gastric cancer；Ubiquitination

(收稿日期2014-03-08修回日期 2014-04-04)

中图分类号：R735.2

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2015)01-0028-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.008

通讯作者：刘敏