血管紧张素Ⅱ灌注在脂质肝损伤中的作用研究

吴娱，张洋，胡泽波，刘亮，王桂花，鲁荐，马坤岭

(东南大学附属中大医院 肾内科，江苏 南京 210009)

·论 著·

血管紧张素Ⅱ灌注在脂质肝损伤中的作用研究

吴娱，张洋，胡泽波，刘亮，王桂花，鲁荐，马坤岭

(东南大学附属中大医院 肾内科，江苏 南京 210009)

目的：通过制备血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)灌注模型，观察AngⅡ在脂质肝损伤中的作用及其可能的机制。方法：将C57BL/6小鼠随机分为对照组、AngⅡ灌注组及AngⅡ灌注加AngⅡ 1型受体(AT1R)基因敲除组。采用HE、菲律宾、油红0染色以及胞内胆固醇定量测定法观察肝细胞内脂质沉积情况；免疫组化、蛋白质印迹法检测低密度脂蛋白受体(LDLR)、固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)及其裂解激活蛋白(SCAP)表达水平。结果：AngⅡ刺激增加C57BL/6小鼠肝细胞内脂质沉积，且上调LDLR、SREBP-2和SCAP的表达。而AT1R基因敲除组C57BL/6小鼠肝细胞内脂质沉积明显减少，LDLR通路的相关蛋白表达也显著下调。结论：AngⅡ通过AT1R诱导LDLR负反馈调节失调，进而增加胆固醇内流、肝细胞内脂质过度沉积，介导脂质肝损伤的发生。

血管紧张素Ⅱ灌注； 低密度脂蛋白受体； 脂质肝损伤

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种以无过量饮酒史，肝实质细胞脂肪性变和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。其病程包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化，最终可能演变为肝硬化[1]和肝癌[2]。近年来，全世界NAFLD的患病率平均为20%[3]，已成为危害人类健康的一种常见的慢性肝脏疾病。目前NAFLD的发病机制尚未明确。近来研究发现，应用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(angiotensinⅡ receptor blocker，ARB)可延缓NAFLD的进展[4]，如替米沙坦能够抑制肝内脂质沉积，且在正常饮食的小鼠模型中，替米沙坦也能减弱胰岛素的抵抗状态[5]，从而改善肝脏的脂肪变性[6]，提示肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)激活可能参与了脂质肝损伤的发生、发展。我们在既往的研究中已经证实，血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)可通过上调低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)的表达，导致细胞摄入胆固醇增加，造成人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial，HK-2)[7]以及系膜细胞[8]内脂质过度沉积，泡沫细胞形成。研究还发现RAS激活与脂代谢紊乱在疾病进展过程中存在交互作用[7]。本研究中，我们通过制备AngⅡ灌注模型，观察AngⅡ在脂质肝损伤中的作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 模型制备及分组

将24只8周龄的清洁级健康雄性C57BL/6小鼠喂以普通饮食，并随机均分为对照组、AngⅡ灌注组(AngⅡ皮下持续泵入)以及AngⅡ 1型受体(AT1R)基因敲除组(AngⅡ+AT1R-/-)。持续饲养4周后处死小鼠，并收集血液标本以及肝脏组织进行相关指标的检测。

1.2 试剂

AngⅡ、焦碳酸二乙酯(DEPC)、苏木素、胆固醇酶酯、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶、4-氨基安替比林、苯酚、磷酸氢二甲缓冲液、胆酸钠、酒石酸钠、福林酚、1，2-丙二醇(美国Sigma)，预染蛋白标记、十二烷基硫酸钠(南京生兴生物技术有限公司)，菲律宾荧光染色试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)、免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)、全蛋白提取试剂盒、蛋白测定试剂盒(南京鹭飞生物技术有限公司)，ECL发光剂(英国GE)，LDLR、固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element-binding protein，SREBP-2)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element-binding protein cleavage activating protein，SCAP)及β-actin抗体(美国Santa Cruz)，辣根过氧化物酶标记的二抗(上海基因科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1肝脏病理学检查 肝脏组织经10%甲醛固定、石蜡包埋，切成3 μm薄片后行HE染色，光镜下观察肝脏组织病理学改变。

1.3.2菲律宾染色 将石蜡包埋后的蜡块切成3 μm薄片后，按菲律宾染色操作步骤说明书进行。

1.3.3胞内胆固醇定量测定 取大小约5 mm×5 mm的新鲜肝脏组织，加入1 ml氯仿与甲醇混合物(2∶1)，采用超声波细胞仪破碎肝脏组织。收集上清液，真空干燥后用化学酶促法定量检测细胞总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)的含量，胆固醇酯(CE)=TC-FC。向试管中沉淀部分加入1 mol·L-1氢氯化钠，孵育12 h后，用Folin-酚试剂法测定总蛋白含量，分别计算胆固醇与细胞内总蛋白的比值，分析其相对含量。

1.3.4免疫组化 石蜡切片脱蜡水化，微波修复抗原，采用SP法免疫组化试剂盒，检测指标包括LDLR、SCAP和SREBP-2(1∶100稀释)，DAB显色2～5 min，显微镜下观察，控制着色时间，苏木素复染，所有操作按照说明书进行。

1.3.5蛋白质印迹 取液氮保存的肝组织，加适量裂解液后匀浆、离心，取上清液检测蛋白浓度。取等量组织蛋白样本变性后SDS-PAGE凝胶电泳，转入PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，然后分别与特异性LDLR、SCAP和SREBP-2抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，再与辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育1 h，洗膜，ECL化学发光法曝光。以β-肌动蛋白(1∶500)作为内参，测定蛋白相对表达水平。

1.4 统计学处理

计量资料数据以均数±标准误表示，多组间比较采用单因素方差分析。使用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AngⅡ促进肝细胞内脂质沉积

HE以及菲律宾染色结果显示，与对照组相比，AngⅡ组小鼠肝细胞内有泡沫细胞形成以及大量脂质沉积，但AT1R敲除的小鼠肝细胞中脂质明显减少，胆固醇定量测定结果与此一致，见图1、2。

图1 AngⅡ促进肝细胞内脂质沉积 A.HE染色×400； B.菲律宾染色×200

Fig 1 AngⅡ promotes lipid accumulation in hepatic cells

a 与对照组比较，P<0.05； b 与AngⅡ组比较，P<0.05

图2 胆固醇定量测定结果

Fig 2 The results of quantitative intracellular cholesterol analysis

2.2 AngⅡ诱导体内LDLR负反馈调节途径紊乱

免疫组化结果显示，LDLR、SCAP和SREBP-2在AngⅡ灌注组小鼠中表达明显增加，而AT1R敲除后的小鼠，其表达明显减少，蛋白质印迹结果也与此一致，见图3。

3 讨 论

早在2002年就有研究者发现，在正常肝细胞内可检测到AT1R[9]，而有关RAS与肝脏疾病的研究也越来越多。RAS能促进肝脏炎症[4]、氧化应激[10]等反应，从而加速肝脏脂肪变性，最后导致NAFLD的发生。近年来研究发现，应用RAS阻断剂可促进小的、对胰岛素更敏感的脂肪细胞形成，从而改善脂肪代谢紊乱[11]，但就RAS激活后对肝细胞内脂代谢紊乱的调节作用研究甚少。

a 与对照组相比，P<0.05； b 与AngⅡ组相比，P<0.05

图3 AngⅡ诱导肝内LDLR负反馈调节途径紊乱 A.免疫组化×400； B、C.蛋白印迹法结果及灰度值定量

Fig 3 AngⅡ disrupts LDLR feedback regulation in the liver

在NAFLD的患者体内，维持肝细胞胆固醇稳态的多个环节遭到破坏，胆固醇内流增加、外流减少以及肠肝循环发生障碍，导致肝细胞内胆固醇沉积和脂肪肝的形成。而肝细胞内胆固醇代谢受多个核因子调节。SREBP-2是调节胆固醇代谢的主要核因子之一，在细胞内胆固醇缺乏时，SREBP-2被激活，从内质网转位到高尔基体，经蛋白酶水解，形成活性的SREBP-2，进入核内，进而上调LDLR等靶基因的转录，增加胆固醇的合成和摄取[12]。既往有研究发现，干扰RAS系统相关蛋白的表达会阻止由高脂饮食诱导的肥胖的发生[13]，此外，将AT1R基因敲除也能减少肝脏发生脂肪变性[14]。我们的研究团队也发现，AngⅡ刺激HK-2细胞会通过破坏LDLR负反馈调节途径，诱导脂质的过度沉积[7]。本研究中，与对照组相比，AngⅡ灌注组的小鼠肝细胞内脂质沉积明显增加，同时LDLR、SCAP和SREBP-2的基因与蛋白水平都显著上调，但敲除AT1R基因后，脂质沉积明显减少，表明AngⅡ破坏了肝细胞内LDLR负反馈调节途径，增加胞内胆固醇的摄入。Lu等[15]研究发现，AngⅡ能增加LDL氧化，氧化型LDL被巨噬细胞摄取，从而促进动脉粥样硬化的形成。研究还发现应用RAS抑制剂能改善肾脏足细胞对脂的代谢，从而延缓肾小球疾病的发展[16-18]。我们首次证实了AngⅡ可通过破坏LDLR信号途径诱导肝细胞对胆固醇的过度摄取，且敲除AT1R基因后能明显抑制脂质对肝细胞的损伤。

综上所述，我们通过AngⅡ灌注模型研究证实，AngⅡ能上调LDLR的表达，从而导致肝细胞内摄取胆固醇增加，胞内脂质过度沉积，进一步通过敲除AngⅡ的作用受体AT1R基因，表明了RAS激活能通过促进肝细胞内脂代谢紊乱而加速脂质肝损伤。本研究为脂质肝损伤疾病如NAFLD的治疗提供了新的思路。

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The role of angiotensinⅡ perfusion in fatty liver injury

WU Yu，ZHANG Yang，HU Ze-bo，LIU Liang，WANG Gui-hua，LU Jian，MA Kun-ling

(DepartmentofNephrology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To investigate the possible effects of angiotensinⅡ(AngⅡ) on fatty liver injury and its possible mechanism via the construction of AngⅡ perfusion model. Methods: C57BL/6 mice were randomly divided into three groups: the control group， the AngⅡ group and the AngⅡ with angiotensinⅡ type 1 receptor(AT1R) gene knockout group. Lipid accumulation was examined with haematoxylin-eosin(HE) staining， Oil red O staining， Filipin staining， and a quantitative assay of intracellular cholesterol. The protein expressions of low-density lipoprotein receptor(LDLR)， sterol regulatory element-binding protein 2(SREBP-2) and its cleavage activating protein(SCAP) were determined by immunochemical staining and Western blotting. Results: AngⅡ stimulation increased lipid deposition in livers of C57BL/6 mice， which was associated with increased protein expression of LDLR，SCAP， and SREBP-2. However， lipid accumulation in hepatic cells of AT1R gene knockout C57BL/6 mice dropped; moreover， the expression of LDLR pathway related protein significantly dropped. Conclusion: AngⅡ disrupts LDLR feed-back regulation via its receptor AT1R to increase cholesterol uptake and induce intracellular lipid accumulation， contributing to the development of liver injury．

angiotensinⅡ perfusion； low density lipoprotein receptor； fatty liver injury

2015-03-23

2015-05-04

国家自然科学基金资助项目(81470957，81170792)；江苏省自然科学基金资助项目(BK20141343)

吴娱(1988-)，女，江苏江阴人，在读硕士研究生。E-mail：wu_yu_126@126.com

马坤岭 E-mail：klma05@163.com

吴娱，张洋，胡泽波，等.血管紧张素Ⅱ灌注在脂质肝损伤中的作用研究[J].东南大学学报：医学版，2015，34(5)：740-744．

R575.5

A

1671-6264(2015)05-0740-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.012