稳转GFP-RAB7的肾小管上皮细胞在缺氧状态下RAB7的表达及位置变化

余文敏，张晓毅，王智，陈平圣，窦骏

(东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

·论 著·

稳转GFP-RAB7的肾小管上皮细胞在缺氧状态下RAB7的表达及位置变化

余文敏，张晓毅，王智，陈平圣，窦骏

(东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

目的：了解缺氧状态下RAB7蛋白在稳转GFP-RAB7表达载体的肾小管上皮细胞中的表达及位置变化，验证其对细胞自噬与内吞现象的指示作用。方法：构建GFP-RAB7表达融合蛋白慢病毒载体转染肾小管上皮细胞(HK-2)，缺氧处理后，采用RT-qPCR、蛋白质印迹技术和激光共聚焦技术检测外源基因RAB7在细胞内的表达及位置的变化。结果：成功将GFP-RAB7基因的表达载体转染到HK-2细胞中，并获得稳定表达GFP-RAB7蛋白的HK-2细胞；在缺氧状态下，RAB7 mRNA的表达轻微降低，蛋白水平没有变化；激光共聚焦显微镜发现GFP-RAB7蛋白发生聚集，显示自噬与内吞的形成。结论：成功建立稳定转染的表达GFP-RAB7的HK-2细胞系，GFP-RAB7融合蛋白可指示自噬与内吞现象，为研究缺氧状况下肾小管上皮细胞自噬与内吞提供了有效工具。

缺氧； GFP-RAB7蛋白； 肾小管上皮细胞； 自噬； 内吞

2000年Fine等[1]提出慢性缺氧假说，强调肾小管间质的慢性缺血损伤是各种肾脏病发展为终末期肾病的共同通路。研究表明，肾小管上皮细胞对缺氧十分敏感，易因此而损伤并释放炎症介质，促进疾病的发展，但具体机制尚未完全搞清[2-3]。

自噬(autophagy)是一种细胞代谢方式，细胞将自身的胞质蛋白和细胞器以形成自噬泡的形式由溶酶体降解，以清除细胞内衰老损伤的细胞器、聚集的变性蛋白和循环再利用氨基酸等。内吞作用(endocytosis)是细胞质膜内陷将细胞外物质转入细胞内的过程。研究显示，缺氧促进细胞自噬和内吞[4]，因此若要揭示慢性肾脏病进展机制，小管上皮细胞自噬和内吞是极为重要的研究领域。尽管检测自噬和内吞的方法较多，但既简便又能动态观察的方法甚少。RAB7存在于自噬体和晚期内吞体膜上，是自噬体和内吞体成熟所必需的共享分子之一[5]。

本实验通过构建和转染慢病毒表达载体，使肾小管上皮细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)和RAB7的融合绿色荧光蛋白；并在体外模拟缺氧状态下，观察GFP和RAB7融合绿色荧光蛋白中的表达及位置变化，为了解肾小管上皮细胞在缺氧状态下发生自噬和内吞的程度提供一种简单、直观的研究工具。

1 材料与方法

1.1 材料

HK-2细胞系购自中科院上海细胞资源库，GFP-RAB7慢病毒过表达载体委托上海吉玛生物公司构建，G418、RIPA蛋白裂解液、丙烯酰胺、化学发光液、BCA蛋白定量试剂盒和荧光定量试剂盒购自诺唯赞生物公司，PVDF膜购自Millipore公司，RAB7抗体购自Abcam公司，HRP标记羊抗兔二抗购自Protech公司，引物由上海桑尼生物公司合成。

1.2 HK-2细胞的培养及转染

1.2.1细胞培养 将HK-2细胞接种于6孔板，细胞密度以确保第2天每孔能达到80%为宜，采用DMEM+10% FBS培养基(无双抗)，置于培养箱中，体积分数5% CO2、37 ℃、饱和湿度下培养。

1.2.2细胞转染及鉴定 按照上海吉玛生物公司提供的说明书进行转染，以终浓度为500 ng·ml-1的G418筛选稳转株。荧光显微镜下观察经DAPI染色的细胞表达绿色荧光蛋白情况，适时荧光定量PCR检测RAB7 mRNA表达水平(具体方法见下述)。

1.2.3实验分组 稳转GFP-RAB7的HK-2细胞分为常氧组和缺氧组。常氧组为正常氧气浓度(O2体积分数21%)的培养条件，体积分数5% CO2、37 ℃培养24 h；缺氧组在CO2/N2/O2体积分数为5%/94%/1%的培养箱培养24 h。分别重复3次。

1.3 RNA提取与适时荧光定量PCR

参照Invitrogen公司的RNA提取试剂盒说明书；反转录采用诺唯赞公司提供说明书。适时荧光定量PCR以GAPDH基因为内参，采用诺唯赞公司的SYBRGreenI嵌合荧光法定量试剂盒，用2-△△t定量法分析数据结果。引物序列为：RAB7基因上游引物5′-CATCCTGGGAGATTCTGGAGTC-3′，下游引物5′-TGTGTCCCATATCTGCATTGTG-3′(产物156 bp)；GAPDH基因：上游引物AAGGTGAAGGTCGGAGTC，下游引物GAAGATGGTGATGGGATTTC(产物150 bp)。

1.4 蛋白提取与蛋白质印迹

收集各组细胞，RIPA蛋白裂解液溶解细胞，以14 000×g、4 ℃离心15 min。将蛋白定量后，取40 μg总蛋白经12%SDS-PAGE凝胶分离，4 ℃恒压转移至PVDF膜上，3% BSA封闭1 h，TBST洗膜5 min，3次。加入RAB7抗体(1∶1 000稀释)。TBST洗膜5 min，3次，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(1∶3 000稀释)孵育1 h，TBS洗膜5 min，3次。ECL显色。以GAPDH抗体(1∶3 000稀释)作为对照。

1.5 激光共聚焦显微镜(LSCM)扫描

稳转GFP-RAB7的细胞铺满孔底80%左右倾去完全培养基，PBS冲洗3遍后加入无血清低糖DMEM。细胞放入培养箱中低氧培养，条件同上，培养24 h后PBS冲洗3遍，用预冷的多聚甲醛固定30 min。在LSCM(奥林巴斯FV1000，日本)下观察并拍摄GFP-RAB7的表达和位置变化情况。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包(SPSS Inc，美国)分析数据。数据以均数±标准差表示。组间差异分析用t检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 稳转GFP-RAB7的HK-2细胞鉴定

荧光显微镜下，稳转GFP-RAB7的HK-2细胞浆内可见高强度翠绿色荧光(图1)，用DAPI染核显示，RAB7蛋白位于细胞质中，表明转染效率为100%及RAB7的表达位置正确。适时荧光定量PCR检测显示稳转细胞RAB7 mRNA表达水平显著高于未转染细胞。转染RAB7蛋白的HK-2细胞在mRNA表达水平是未转染HK-2细胞的48.0±2.86倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 稳转细胞GFP-RAB7绿色荧光蛋白表达情况 A.细胞核显示深蓝色荧光(DAPI染色，20×10)； B.胞浆呈现翠绿色荧光(20×10)； C.细胞核荧光与胞浆荧光重合图(20×10)

Fig 1 The expression of stably transfected GFP-RAB7 in HK-2 cellsA.Nuclear staining showed blue fluorescence with DAPI(DAPI staining，20×10); B.The Cytoplasm presented green fluorescence(20×10); C.The merge of nucleus fluorescence and green fluorescence in cytoplasm(20×10)

2.2 缺氧状态下GFP-RAB7的位置变化

通过LSCM在高倍视野下观察发现，常氧组细胞GFP-RAB7荧光颗粒散在分布于细胞质中，无聚集发生；缺氧之后细胞自噬与内吞增强，RAB7蛋白在细胞质中荧光颗粒明显聚集，显示细胞自噬与内吞的发生，并有靠近细胞核周围的趋势(图2)。常氧组细胞GFP-RAB7荧光颗粒散在分布于细胞质中；缺氧组细胞质中荧光颗粒聚集，主要分布在细胞核周围。

图2 缺氧状态下GFP-RAB7荧光颗粒位置变化(LSCM)

Fig 2 The position change of GFP-RAB7 green fluorescent protein in HK-2 cells under hypoxia(LSCM)

2.3 缺氧状态下GFP-RAB7稳转细胞的RAB7 mRNA表达情况

缺氧状态下，稳转GFP-RAB7的HK-2细胞的RAB7蛋白尽管位置发生变化，RAB7的mRNA水平的表达有所减少，常氧组的表达量为1.0±0.32，缺氧组为0.8±0.06，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 缺氧状态下GFP-RAB7稳转细胞的RAB7蛋白的表达情况

蛋白质印迹检测显示，缺氧和常氧状态下GFP-RAB7的HK-2细胞中RAB7蛋白的表达没有变化(图3)。

图3 缺氧和常氧状态下GFP-RAB7稳转细胞RAB7蛋白表达和比较 A.RAB7蛋白表达； B.RAB7蛋白表达比较； 1、2.常氧； 3、4.缺氧

Fig 3 The expression and comparison of RAB7 in HK-2 cell with GFP-RAB7 protein in normoxia and hypoxiaA.The expression of RAB7 protein; B.The comparison of RAB7 protein； 1，2.normoxia； 3，4.hypoxia

3 讨 论

在慢性肾脏病，肾小管周围微血管往往呈进行性缺失，引起或加重肾间质缺氧，并且缺氧刺激下的血管新生反应又明显不足，最终使纤维化呈进行性发展。研究显示肾近端小管细胞可能是缺氧损伤的主要目标[6]；损伤的肾小管上皮细胞释放多种炎症介质参与纤维化的发展[7]。因此，研究缺氧情况下肾小管上皮细胞的代谢及功能变化，对于了解肾脏纤维化形成机制大有裨益。自噬和内吞是细胞进化上极为保守的代谢方式，缺氧状况下，细胞自噬、内吞活跃，且常相伴发生，阐释其变化程度与细胞功能状态的关系无疑是十分重要的。

透射电子显微镜仍然是检测自噬和内吞现象的金标准，但样品制作繁琐，设备昂贵，有时清晰度欠佳，最欠缺之处是不能动态观察。有研究显示，利用GFP-LC3融合蛋白特异性定位自噬泡，通过观察细胞内荧光颗粒的量及分布情况，可以实时监测细胞自噬的进程，现已成为研究细胞自噬的重要方法[6，8-9]。但是GFP-LC3的融合蛋白仅能显示自噬程度，不能反映内吞程度，也就无法全面显示细胞的自噬与内吞的水平。

Rab7存在于自噬体和晚内吞体膜上，是自噬体和内吞体成熟所必需的共享分子之一，属小GTP酶，能导引胞内货物沿微管运输，最后参与自噬体和内吞体与溶酶体的融合过程，目前认为该分子是调控自噬和内吞的关键分子[5]。

本研究将GFP-RAB7慢病毒表达载体转染人的肾小管上皮细胞系，通过观察细胞内荧光强度和RAB7基因表达，证实稳定转染细胞株构建成功。经缺氧处理后，稳定转染GFP-RAB7的细胞中出现大量绿色荧光颗粒聚集于细胞核附近，有别于非缺氧细胞的荧光颗粒分布，结合其他作者相关报道[6]，我们认为该现象提示GFP-RAB7荧光融合蛋白能反映细胞自噬与内吞活动。但是在缺氧状态下，该稳转细胞株并未出现RAB7表达量的明显变化，说明缺氧可能不影响RAB7的基因活动，只影响其在细胞内的分布，进一步说明慢病毒融合蛋白指示自噬与内吞现象的特异性。由于稳转细胞株能传代培养，这就为后续研究HK-2细胞自噬与内吞提供了有效工具，同时也可以作为反映细胞缺氧程度的候选分子标记。

综上，本实验成功构建了稳转GFP-RAB7表达载体的肾小管上皮细胞系，使缺氧状态下细胞自噬和内吞程度得以实时监测，为深入研究慢性肾脏病的发生发展机制提供了便利，但仍需进一步观察转染细胞形态学特点、生物学行为以及功能变化，以便为推广应用打下坚实基础。

[1] FINE L G，BANDYOPADHAY D，NORMAN J T.Is there a common mechanism for the progression of different types of renal diseases other than proteinuria?Towards the unifying theme of chronic hypoxia[J].Kidney Int，2000，75:S22-26.

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[3] LI J,FAN R,ZHAO S,et al.Reactive oxygen species released from hypoxic hepatocytes regulates MMP-2 expression in hepatic stellate cells[J].Int J Mol Sci,2011，12:2434-2447.

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Changes of expression and location of RAB7 in HK-2 cells stably transfected GFP-RAB7 protein under hypoxia

YU Wen-min，ZHANG Xiao-yi，WANG Zhi，CHEN Ping-sheng，DOU Jun

(SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To establish the HK-2 cell line (human proximal tubular cells) stably transfected an expressing vector of human GFP-RAB7 fused protein，and detect its indicative function of autophagy and endocytosis under hypoxia. Methods: Lentiviral expression vector of human GFP-RAB7 fused protein was constructed， and then stably transfected to HK-2 cell line. The expression and location of GFP-RAB7 were detected by RT-qPCR， Western blot and laser scanning confocal microscope(LSCM). Results: The HK-2 cells transfected the vector stably expressed GFP-RAB7 fused protein. These results indicated that the level of RAB7 mRNA was decreased under hypoxic conditions， while hypoxia did not affect the expression of total amount of RAB7 protein. The result of LSCM showed the aggregation of GFP-RAB7 and formation of autophagosome in transfected HK-2 cells under hypoxia. Conclusion: We have successfully constructed a stable transfected HK-2 cell line which expresses GFP-RAB7 protein. The fuse protein could be a good indicator for autophagy and endocytosis. It may provide a simple and effective method for studying autophagy and endocytosis in cells.

hypoxia; GFP-RAB7 protein; proximal tubular cell; autophagy; endocytosis

2015-06-29

2015-07-11

国家自然科学基金资助项目(81370868)；中央高校基本科研业务费专项资金项目；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(KYLX_0197)

余文敏(1978-)，男，江西九江人，在读博士研究生。E-mail:yuwenmin2013@126.com

陈平圣 E-mail：chenpsh@sina.com 窦骏 E-mail:njdoujun@seu.edu.cn

余文敏，张晓毅，王智，等.稳转GFP-RAB7的肾小管上皮细胞在缺氧状态下RAB7的表达及位置变化[J].东南大学学报：医学版，2015，34(5)：710-714．

R361.3； R364.4

A

1671-6264(2015)05-05-0710-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.006